Implicación de las modificaciones de tRNA y del metabolismo de los folatos en la respuesta inmune de Arabidopsis

Abstract

Throughout evolution, plants have developed a sophisticated network of signaling pathways allowing the activation and regulation of immune responses. The identification of metabolic pathways which are involved in modulating the intensity of that immune responses is an important challenge in the field of plant-pathogen interaction. With this aim, we performed two genetic approaches in Arabidopsis thaliana against the disease caused by the hemibiotroph bacterial pathogen Pseudomonas syringae DC3000. We demonstrate that the regulation of two pathways, related between them, is crucial to activate an effective immune response. By means of a genetic screening of regulators components of plant immunity, we identified the mutant scs9 (suppressor of csb3) which shows an affected resistance that triggers a enhanced susceptibility to P.s. DC3000 through an independent pathway of salicylic acid (SA)-mediated immune response. The cloning and characterization of SCS9 reveals that it codes for 2'-O-ribose tRNA methyltransferase. Our results indicate that the SCS9-mediated methylation of nucleosides N32 and N34, located in the tRNAs anticodon loop, is crucial for the plant immunity effectiveness. On the other hand, with a chemical genetic screening of agonist molecules of the immune response, we identified the sulfonamides as priming inducer molecules that exhibit a faster and/or stronger activation of SA-related defense responses and enhanced resistance to P.s. DC3000. Analysis of the mechanism of action of these molecules reveals that synthesis and accumulation of folates exert a SA-independent negative control on the immune response to P.s. DC3000. Through comparative proteomic analysis we identified the 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate homocysteine methyltransferase 1 (methione synthase, here named as METS1), enzyme responsible of the methionine synthesis in the folate-dependent 1C metabolism and overaccumulated in scs9 mutants, as modulator component in the immune response to P.s. DC3000. We observed that the overexpression of METS1 in transgenic plants of Arabidopsis suppresses plant immune responses and promotes enhanced susceptibility to P.s. DC3000. This repressor effect is due to a genome-wide increase in DNA methylation level, which is mediated by the overaccumulation of METS1 and the consequent increase of folate-dependent methionine synthesis. Therefore, the findings of this work provide a deeper knowledge about the mechanisms by which the DNA methylation and epigenetic regulation exert an influence on plant immunity through folate metabolism, particularly by METS1, whose synthesis is regulated through specific tRNA modifications mediated by SCS9.

Las plantas, a lo largo de la evolución, han desarrollado un sofisticado entramado de rutas de señalización que permiten la activación y el control de la respuesta inmune. Identificar qué procesos metabólicos participan en modular la amplitud de dicha respuesta inmune es un reto en el campo de la interacción planta-patógeno. Con este propósito, se han utilizado dos aproximaciones genéticas llevadas a cabo en Arabidopsis thaliana contra la infección por la bacteria hemibiotrofa Pseudomonas syringae DC3000. Los resultados ponen de manifiesto la importancia de la regulación de dos mecanismos, a su vez relacionados, para la activación de una respuesta inmune efectiva. Mediante un rastreo genético en busca de componentes reguladores de la inmunidad, identificamos el mutante que denominamos scs9 (supresor de csb3). scs9 muestra una resistencia afectada que conlleva un incremento en la susceptibilidad a P.s. DC3000 a través de un mecanismo independiente a la respuesta inmune mediada por ácido salicílico (SA). La clonación y caracterización de SCS9 revela que codifica una 2'-O-ribosa metiltransferasa de tRNA. Nuestros resultados indican que la modificación por metilación mediada por SCS9 de los nucleósidos N32 y N34 de la región anticodón de los tRNAs, es clave para la inmunidad de la planta. Por otro lado, mediante un rastreo de genética química en busca de moléculas agonistas de la respuesta inmune, identificamos un grupo de sulfonamidas como moléculas activadoras de un mecanismo de priming. Este conlleva una más rápida y/o más intensa activación de la respuesta defensiva dependiente de SA y de un incremento de la resistencia frente a P.s. DC3000. El análisis del mecanismo de acción de dichas moléculas revela que la síntesis y acumulación de folatos ejerce un control negativo sobre la respuesta inmune frente a P.s. DC3000; y ese control es ejercido de manera independiente a la ruta de señalización mediada por SA. A través de un análisis proteómico comparativo identificamos la proteína 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato homocisteína metiltransferasa 1 (metionina sintasa, denominada aquí METS1), responsable de la síntesis de metionina en el metabolismo C1 dependiente de folatos y sobreacumulada en los mutantes scs9. Esta proteína participa entonces como componente modulador de la respuesta inmune a P.s. DC3000. La sobreexpresión de METS1 en plantas transgénicas observamos que suprime la respuesta inmune y conlleva a un incremento en la susceptibilidad frente a P.s. DC3000. Dicho efecto represor de la resistencia acontece a raíz de un incremento del nivel de metilación de DNA en todo el genoma mediado por la sobreacumulación de METS1 y del consiguiente posible aumento en la síntesis de metionina dependiente de folatos. Por tanto, estos resultados ahondan en el conocimiento de cómo la metilación de DNA y el control epigenético ejercen una influencia sobre la respuesta inmune. Esta influencia puede ser controlada a través del metabolismo de folatos, y en particular a través de METS1, enzima cuya síntesis está a su vez controlada por determinadas modificaciones de tRNA mediadas por SCS9.

Les plantes, al llarg de l'evolució, han desenvolupat un sofisticat entramat de rutes de senyalització que permeten l'activació i el control de la resposta immune. Identificar quins procesos metabòlics participen en la modulació de l'amplitud d'aquesta resposta immune és un repte en el camp de la interacció planta-patogen. Amb aquest propòsit, s'han utilitzat dues aproximacions genètiques en Arabidopsis thaliana en resposta a la infecció pel bacteri hemibiotrofo Pseudomonas syringae DC3000. Els resultats posen de manifest la importància de la regulació de dos mecanismes, al seu torn relacionats, per a l'activació d'una resposta immune efectiva. Mitjançant un rastreig genètic per a la recerca de components reguladors de la immunitat, es va identificar el mutant que denominem scs9 (supresor de csb3). scs9 mostra una resistència afectada que comporta un increment en la susceptibilitat a P.s. DC3000 fent ús d'un mecanisme independent a la resposta immune mediada per l'àcid salicílic (SA). La clonació i caracterització de SCS9 revela que codifica una 2'-O-ribosa metiltransferasa de tRNA. Els nostres resultats indiquen que la modificació per metilació mediada per SCS9 dels nucleòsids N32 i N34 de la regió anticodó dels tRNAs, és clau per a la immunitat de la planta. D'altra banda, per mitjà d'un rastreig de genètica química per a la recerca de molècules agonistes de la resposta immune, es va identificar un grup de sulfonamidas com a molècules activadores d'un mecanisme de priming. Aquest, comporta una més rápida i/o més intensa activació de la resposta defensiva dependent de SA i d'un increment de la resistència enfront de P.s. DC3000. L'anàlisi del mecanisme d'acció d'aquestes molècules revela que la síntesis i acumulació de folats exerceix un control negatiu sobre la resposta immune davant el bacteri P.s. DC3000; i eixe control és exercit de manera independent a la ruta de senyalització mediada per SA. Amb un anàlisi proteòmic comparatiu es va identificar la proteïna 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato homocisteína metiltransferasa 1 (metionina sintasa, denominada ací METS1), responsable de la síntesi de metionina al metabolisme C1 dependent de folats i sobreacumulada en els mutants scs9. Aquesta, així doncs, es troba participant com a component modulador de la resposta immune a P.s. DC3000. La sobreexpressió de METS1 en plantes transgèniques suprimeix la resposta immune i comporta a un increment en la susceptibilitat per P.s. DC3000. L'efecte repressor de la resistència succeïx arran d'un increment del nivell de metilació de DNA en tot el genoma, mediat per la sobreacumulació de METS1 i del consegüent posible augment en la síntesi de metionina dependent de folats. Per tant, aquests resultats aprofundixen en el coneixement de com la metilació de DNA i el control epigenètic exerceixen una influència sobre la resposta immune. Aquesta influència pot ser controlada mitjançant el metabolisme de folats, i en particular a través de l'enzim METS1, la síntesi de la qual està al seu torn controlada per determinades modificacions de tRNA mediades per SCS9.