Especies de Xanthomonas causantes de enfermedades en frutales de hueso y almendro: diagnóstico, diversidad genética y taxonomía

Abstract

Xanthomonas arboricola pv. pruni is the causal agent of the bacterial spot disease of stone fruits, almond and ornamental species of Prunus. This pathogen constitutes one of the major threats to this group of species due to the economic losses it generates, and it is therefore considered as a quarantine organism in the European Union (EU). Recently, several outbreaks of the disease have been described in EU countries including Spain, where this pathogen has been detected in seven regions. Given the importance of this emerging disease and the lack of information about it, several aspects related to its diagnosis and epidemiology have been addressed in this work. Additionally, taxonomic characterization of three atypical Xanthomonas strains isolated from nectarines, causing similar symptoms to those produced by X. arboricola pv. pruni, have also been performed. First, a prototype of lateral flow immunoassay has been designed for the diagnosis of bacterial spot disease. It was developed by producing two polyclonal antibodies which were then combined with carbon nanoparticles and assembled on nitrocellulose strips. The specificity of the immunoassay was tested, obtaining a positive result with all the strains of X. arboricola pv. pruni analyzed. The limit of detection observed was 104 CFU/ml, which is sufficient for the detection of this pathogen in symptomatic samples. To demonstrate the accuracy and the reliability of the immunoassay, the prototype developed was used in the analysis of naturally infected field samples and healthy samples. Results were compared to those obtained by plate isolation and real time PCR, and a high correlation among techniques was observed. In a second step, as X. arboricola pv. pruni was first detected in Spain in 2002, and in subsequent years several outbreaks have occurred in 11 provinces, it was considered of interest to study the relationships between a collection of 239 Spanish strains of this pathogen originated from nurseries, orchards and interceptions with the technique of the Multilocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis (MLVA). This method confirmed its high discriminatory power and the strains were grouped in 18 genetic clusters. The results obtained suggest multiple introductions of X. arboricola pv. pruni in Spain, and the leading role of the nurseries in the introduction and dissemination of this pathogen through the commercialization of contaminated plant propagation material. Finally, three strains isolated from nectarines in Murcia showing similar symptoms to those produced by X. arboricola pv. pruni, were analyzed using both phenotypic and molecular methods. The first results of biochemical tests and PCR were negative for this pathogen. Therefore, these isolates have been subjected to a taxonomic characterization through a polyphasic approach, comparing them with reference strains of other Xanthomonas species. Additionally, inoculations on peach plants demonstrated the pathogenicity of the three strains. The results obtained confirmed that these strains constitute a new species of the genus Xanthomonas, for which the name Xanthomonas prunicola has been proposed, and its main differential characteristics from the other species of this genus have been defined. Overall, the studies collected in this thesis provide a rapid method for on-site diagnosis of the bacterial spot disease, a deeper knowledge of the genetic diversity of the Spanish strains of X. arboricola pv. pruni and the development of a new methodology for its evaluation, as well as the description of a new Xanthomonas species that affects nectarine.

Xanthomonas arboricola pv. pruni es el agente causal de la mancha bacteriana de los frutales de hueso, el almendro y especies ornamentales del género Prunus. Este patógeno constituye una de las mayores amenazas para estas especies debido a las pérdidas económicas que genera, por lo que está considerado como un organismo de cuarentena en la Unión Europea (UE). Se han descrito numerosos brotes en países miembros de la UE en los últimos años y entre ellos en España, donde ha sido detectada la bacteria en siete Comunidades Autónomas. Ante la importancia de esta enfermedad emergente y la carencia de información sobre la misma, en este trabajo se han abordado aspectos relacionados con su diagnóstico y epidemiología que permitirán ampliar nuestro conocimiento sobre ella. Además, también se ha realizado la caracterización taxonómica de tres cepas atípicas de Xanthomonas aisladas de nectarino, que causan síntomas similares a los producidos por X. arboricola pv. pruni. En primer lugar, se ha desarrollado un prototipo de tiras inmunológicas de flujo lateral para el diagnóstico de la mancha bacteriana. Para su diseño, se partió de dos anticuerpos policlonales que se combinaron con nanopartículas de carbono y se ensamblaron en membranas de nitrocelulosa. Se analizó la especificidad de las tiras, obteniendo resultado positivo con todas las cepas de X. arboricola pv. pruni ensayadas. El límite de detección obtenido con las tiras de flujo lateral fue de 104 UFC/ml, que es suficiente para la detección de esta bacteria en muestras sintomáticas. Para comprobar su fiabilidad y precisión, el prototipo desarrollado se utilizó en el análisis de muestras de campo naturalmente infectadas y muestras sanas, y los resultados se compararon con los obtenidos en el aislamiento en medio de cultivo y los de PCR en tiempo real, observándose una elevada correlación entre las tres técnicas. En segundo lugar, como X. arboricola pv. pruni se detectó por primera vez en España en 2002, y desde entonces se han producido brotes de la enfermedad en 11 provincias, se consideró de interés estudiar las relaciones existentes entre una colección de 239 cepas españolas de esta bacteria procedentes de viveros, plantaciones e intercepciones, con la técnica del "Multilocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis" (MLVA). Se demostró su gran poder de resolución ya que permitió clasificar las cepas en 18 grupos genéticos. Los resultados obtenidos sugieren que en España se han producido múltiples introducciones de la bacteria, y que los viveros han jugado un papel importante en la introducción y diseminación del patógeno a través de la comercialización de material vegetal contaminado. Por último, se analizaron fenotípica y molecularmente tres cepas aisladas en nectarinos de la provincia de Murcia, que mostraban síntomas similares a los causados por X. arboricola pv. pruni. Los primeros análisis basados en test bioquímicos y PCR resultaron negativos para este patógeno. Por tanto, se ha llevado a cabo la caracterización taxonómica de dichos aislados a través de un estudio polifásico, comparándolos con cepas de referencia de otras especies de Xanthomonas. Además, se realizaron inoculaciones que confirmaron la patogenicidad de las cepas. Los resultados obtenidos han permitido clasificar estas cepas como una nueva especie del género Xanthomonas, para la que se ha propuesto el nombre de Xanthomonas prunicola y para la que se han definido sus características diferenciales de las otras especies de este género. Los trabajos presentados en esta memoria han aportado un nuevo método rápido de diagnóstico in situ de la mancha bacteriana, el desarrollo una nueva metodología para la evaluación de la diversidad genética de una selección de cepas españolas de X. arboricola pv. pruni, así como la descripción de una nueva especie de Xanthomonas que afecta a nectarino.

Xanthomonas arboricola pv. pruni és l'agent causal de la taca bacteriana dels fruiters d'os, l'ametler i espècies ornamentals del gènere Prunus. Aquest patogen constitueix una de les majors amenaces per a aquestes espècies a causa de les pèrdues econòmiques que genera, per la qual cosa està considerat com un organisme de quarantena en la Unió Europea (UE). S'han descrit nombrosos brots en països membres de la UE en els últims anys i entre ells a Espanya, on ha sigut detectat el bacteri en set Comunitats Autònomes. Davant la importància d'aquesta malaltia emergent i la manca d'informació sobre aquest tema, en aquest treball s¿han abordat aspectos relacionats amb el seu diagnòstic i epidemiologia que permetran ampliar el nostre coneixement sobre ella. A més, també s'ha realitzat la caracterització taxonòmica de tres ceps atípics de Xanthomonas aïllats de nectariner, que causen símptomes similars als produïts per X. arboricola pv. pruni. En primer lloc, s'ha desenvolupat un prototip de tires immunològiques de flux lateral per al diagnòstic de la taca bacteriana. Per al seu disseny, es va partir de dos anticossos policlonals que es van combinar amb nanopartícules de carboni i es van assemblar en membranes de nitrocel¿lulosa. Es va analitzar l'especificitat de les tires obtenint resultat positiu amb tots els ceps de X. arboricola pv. pruni assajats. El límit de detecció obtingut amb les tires de flux lateral va ser de 104 UFC/ml, que és suficient per a la detecció d'aquest bacteri en mostres amb símptomes de la malaltia. Per a comprovar la seua fiabilitat i precisió, el prototip desenvolupat es va utilitzar en l'anàlisi de mostres de camp naturalment infectades i mostres sanes, i els resultats es van comparar amb els obtinguts en l'aïllament en medi de cultiu i els de PCR en temps real, observant-se una elevada correlació entre les tres tècniques. En segon lloc, com que X. arboricola pv. pruni es va detectar per primera vegada a Espanya en 2002, i des de llavors s¿han produït brots de la malaltia en 11 províncies, es va considerar d'interès estudiar les relacions existents entre una col¿lecció de 239 ceps espanyols d'aquest bacteri procedents de vivers, plantacions i intercepcions amb la tècnica del "Multilocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis" (MLVA). Es va demostrar el seu gran poder de resolució ja que va permetre classificar els ceps en 18 grups genètics. Els resultats obtinguts suggereixen que a Espanya s'han produït múltiples introduccions del bacteri, i que els vivers han jugat un paper important en la introducció i disseminació del patogen a través de material vegetal contaminat. Finalment, es van analitzar fenotípicament i molecularment tres ceps aïllats en nectariners de la província de Múrcia, que mostraven símptomes similars als causats per X. arboricola pv. pruni. Les primeres anàlisis basades en test bioquímics i PCR van resultar negatius per a aquest patogen. Per tant, s'ha dut a terme la caracterització taxonòmica de dits aïllats a través d'un estudi polifàsic, comparant aquests amb ceps de referència d'altres espècies de Xanthomonas. A més, es van realitzar inoculacions que van confirmar la patogenicitat dels ceps. Els resultats obtinguts han permés classificar aquests ceps com una nova espècie del gènere Xanthomonas, per a la qual s'ha proposat el nom de Xanthomonas prunicola, i per a la que s'han definit les seues característiques diferencials de les altres espècies d'aquest génere. Els treballs presentats en aquesta memoria han aportat un nou mètode ràpid de diagnòstic in situ de la taca bacteriana, el desenvolupament d'una nova metodologia per a l'avaluació de la diversitat genètica d'una selecció de ceps espanyols de X. arboricola pv. pruni, així com la descripció d'una nova espècie de Xanthomonas que afecta al nectariner.