Sobreexpresión, purificación y caracterización de proteínas involucradas en la exportación nuclear del ARN

Abstract

[ES] La exportación nuclear del mRNA está coordinada con las diferentes etapas de la expresión génica. En las células de los organismos eucariotas existen diferentes orgánulos donde se realizan las funciones celulares, incluyendo el crecimiento, desarrollo y diferenciación celular. En el núcleo celular es donde se encuentra la información genética almacenada en el DNA, y donde ocurre la replicación y reparación del DNA, la transcripción y el procesamiento del RNA. La traducción de las proteínas ocurre exclusivamente en el citoplasma. Por ello, a través del complejo de poro nuclear, el mRNA y otras macromoléculas se transportan al citoplasma. Hay proteínas adaptadoras del transporte de mRNA que actúan como un sistema de control para prevenir una incorrecta exportación nuclear causada por un mal procesamiento o ensamblaje de las ribonucleoproteínas. En este proyecto se pretenden generar mutantes puntuales de una serie de construcciones de Mip6, proteínas celulares de unión a la proteína Mex67, un elemento fundamental en la exportación del RNA desde el núcleo al citoplasma. Se generarán una serie de mutantes por biología molecular para poder proceder a su sobreexpresión y purificación. Según las cantidades obtenidas se procederán a distintos tipos de caracterización biofísica. En primer lugar se procederá a la obtención de mutantes de una supuesta secuencia de exportación nuclear (NES) con el objetivo de validarla como tal. La presencia o no de un NES en Mip6, proteína de unión a Mex67 tiene importantes implicaciones funcionales en su biología y en la interpretación de sus asociaciones con Mex67. También se procederá a la sobreexpresión y purificación de la unidad mínima de interacción de Mip6 con Mex67 con el objetivo de iniciar series de cristalización para poder resolver su estructura cristalina en un futuro. Por otra parte, mediante técnicas de clonaje se pretende caracterizar las proteínas Mex67 y Dbp5, dos proteínas involucradas en el transporte nuclear.[EN] The nuclear export of mRNAs is coordinated with different steps of gene expression. Eukaryotic organisms have a physical and functional compartmentalization of the cells into organelles that are the sites where cellular activities occur, including growth, development, and differentiation. Genetic information is stored in the cell nucleus in the form of chromosomal DNA, in this compartment, DNA replication and repair, transcription of genes, and RNA processing occur. Protein translation occurs exclusively in the cytoplasm. Thus, mRNAs and other macromolecules are transported into the cytoplasm through the NPC. There are adaptor proteins to control and prevent an improperly processed or assembled ribonucleoproteins. Mip6 is a protein that interacts with the protein Mex67, which is a component of the nuclear pore involved in nuclear mRNA export from the nucleus to the cytoplasm. It aims to generate different mutants by molecular biology to overexpress and purify these constructs. Depending on the quantities of protein obtained, different types of biophysical characterization will be carried out. The first step is to obtain the mutants of a determinate nuclear export sequence (NES) in order to validate it as such. The presence of NES in Mip6 has important functional implications in her biology and in the characterization of their associations with Mex67. Moreover, the overexpression and purification of the minimal interaction unit of Mip6 with Mex67 is going to be done with the objective to make crystallization series to be able to solve its crystalline structure in the future. Furthermore, cloning techniques used in this work will provide a characterization of Mex67 and Dbp5 proteins, which are two proteins involved in nuclear transport.