Caracterización de la morfología y la interacción con el agua de hidrogeles inyectables de gelatina y ácido hialurónico para ingeniería tisular

Abstract

[EN] Recent advances in tissue engineering have led to the development of polymer scaffolds with suitable characteristics and properties capable of mimicking natural tissue and fulfilling the different functions that the extracellular matrix (ECM) performs during the stages of tissue regeneration. In the natural tissue, ECM serves as a structural support, allows cell adhesion, migration and proliferation as well as transport of nutrients and metabolic wastes. Specifically, in the extracellular matrix of soft tissues, components such as collagen, hyaluronic acid or fibronectin perform these functions in a highly hydrated environment. In the present Master thesis, the synthesis and characterization of a family of injectable gelatin hyaluronic acid hydrogel mixtures modified with tyramine for the regeneration of soft tissues was carried out. Both components have good biocompatibility and biodegradability, avoiding any rejection reaction of the organism after their implantation. The combination of the two hydrogelsis intended to improve the properties of the pure components since, while gelatin provides cellular adhesion sequences (RGD), hyaluronic acid provides better mechanical properties and greater hydration. The cross-linking of the hydrogels was carried out enzymatically by the combined action of the enzyme peroxidase and the hydrogen peroxide at non-cytotoxic amounts. As the hydrogels are injectable, the gel precursors with bioactive agents can be administered to the patient by a syringe in the liquid state, and gelification takes place in the body. In this way, the total and homogeneous occupation of the defect is assured regardless of the shape of the defect, besides not requiring invasive surgeries for implantation of the hydrogels in the patient. One series of hydrogels with different percentages of gelatin and hyaluronic acid were performed and the physico-chemical characterization of them was carried out in order to select the best composition for a future application in tissue engineering. For that, on the one hand, the molecular weight and degree of tyramine grafting of the raw materials, gelatin and hyaluronic acid, were studied. On the other hand, macroscopic and microscopic morphology of synthesized hydrogels was analysed by field emission scanning electron microscopy. Their water retention capacity, the miscibility of the different mixtures and the interactions of the polymer with water were studied by differential scanning calorimetry test at different relative humidities in order to simulate the different moist environments in which the cells can be found in the tissue. Although the mechanical properties and cell response of these matrices had been previously characterized in the research group, it is for the first time that a deep study of their miscibility at different water activity conditions. Another novelty of this study is the evaluation of the different states of water in the hydrogels. The conclusions here extracted explain the microscopic environment the cells find when they are encapsulated in the hydrogels at different hydration levels and can serve us explain the results on cell differentiation found in the other works of the research group.

[ES] Los recientes avances en ingeniería tisular han dado lugar al desarrollo de andamiajes polímeros con características y propiedades adecuadas capaces de imitar el tejido natural y cumplir las diferentes funciones que la matriz extracelular lleva a cabo durante las etapas de regeneración del tejido. En el tejido natural, la matriz extracelular (ECM) sirve como soporte estructural, permite la adhesión, migración y proliferación celular, así como el transporte de nutrientes y deshechos metabólicos. Concretamente, en la ECM de los tejidos blandos, componentes tales como el colágeno, el ácido hialurónico o la fibronectina realizan estas funciones en un ambiente altamente hidratado. En el presente Trabajo Final de Master se ha realizado la síntesis y la caracterización de una familia de mezclas de hidrogeles inyectables de gelatina y ácido hialurónico modificados con tiramina de cara la regeneración de tejidos blandos. Ambos componentes presentan una buena biocompatibilidad y biodegradabilidad, evitando cualquier reacción de rechazo del organismo tras su implantación. Mediante la combinación de los dos hidrogeles se pretende mejorar las propiedades de los dos componentes puros ya que, mientras la gelatina proporciona secuencias de adhesión celular (RGD), el ácido hialurónico proporciona mejores propiedades mecánicas y una mayor hidratación. El entrecruzamiento de los hidrogeles se ha llevado a cabo enzimáticamente mediante la acción combinada de la enzima peroxidasa y el peróxido de hidrógeno en cantidades no citotóxicas. Como los hidrogeles son inyectables, soluciones acuosas de sus precursores pueden ser administradas al paciente por medio de una jeringa en estado líquido, y la gelificación tiene lugar en el cuerpo. De este modo, se asegura la ocupación total y homogénea del defecto independientemente de la forma de éste además de no requerirse cirugías invasivas para la implantación de los hidrogeles en el paciente. Se han realizado una serie de hidrogeles con distintas proporciones de gelatina y ácido hialurónico y se ha llevado a cabo la caracterización físico-química de éstos de cara a seleccionar la mejor composición para una futura aplicación en ingeniería tisular. Para ello, por un lado, se ha analizado el peso molecular y el grado de injerto de tiramina de los materiales de partida, gelatina y ácido hialurónico y, por el otro, los hidrogeles sintetizados fueron analizados morfológicamente a nivel macroscópico y microscópico mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo. La capacidad de absorción de agua y la miscibilidad de las diferentes mezclas, así como las interacciones del polímero con el agua han sido estudiadas mediante calorimetría diferencial de barrido a distintas humedades relativas con el objetivo de simular los diferentes entornos húmedos en los que se pueden encontrar las células en el tejido. Aunque las propiedades mecánicas y la respuesta celular de estas matrices ya han sido caracterizadas en el grupo de investigación, es la primera vez que se ha realizado un estudio exhaustivo de la miscibilidad de las matrices en entornos de distinta actividad del agua. Otra de las novedades del estudio es la evaluación de los diferentes estados del agua en los hidrogeles. Las conclusiones aquí extraídas explican el entorno microscópico que las células encuentran cuando están encapsuladas en los hidrogeles a diferentes niveles de hidratación que pueden servirnos para explicar los resultados de diferenciación celular encontrados en otros trabajos del grupo de investigación.