La ruta FUL-AP2 y la longevidad de los meristemos en Arabidopsis thaliana. Bases moleculares y potencial biotecnológico

Abstract

The development of all organs of the plant depends on the activity of the meristems and adjacent areas. Monocarpic plants show only one reproductive cycle before they senescence and die. The senescence and death of these plants is preceded by a global proliferative arrest of meristems (GPA). That way, the number of fruits/flowers that they produce during their lives depends on the proliferative activity of apical meristems of the branches and on the time GPA occurs. The study of the mechanisms that control GPA, as well as a better knowledge of genes involved in the maintenance of merismatic cells during this process, can provide useful tools for crop breeding programs in order to obtain more productive varieties. The GPA is a phenomenon described more than a century ago for some monocarpic plants. Different hypothesis have been set out about the factors that trigger it. Among the factors than might be involved, the existence of source-sink relationships or the regulation of the meristem activity by the reproductive organs in development have been proposed. Regarding reproductive organs, a signalling role of developing seeds is well established, as in sterile plants or in plants where fruits are continuously pruned the GPA is significantly delayed. In our group, it has been recently described the first genetic pathway proposed to regulate the longevity of the meristem in monocarpic plants. This pathway includes transcription factors such as FRUITFULL (FUL) and APETALA2 (AP2) to control the temporal onset of this process in Arabidopsis thaliana. Our model proposes that levels of expression of miR172 and FUL increase with the age of the plant as consequence of the decrease of miR156 and the upregulation of SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPLs) transcription factors. The increase of the expression of FUL and miR172 causes the downregulation of AP2, which causes the progressive decrease of WUSCHEL (WUS) expression, and therefore, the cessation of meristematic activity and appearance of GPA. In the first chapter of this PhD thesis, we have aimed to gain further knowledge in the study of longevity control of the meristems by the FUL-AP2 pathway, identifying molecular targets or interactors of AP2. In the second chapter, we have screened different mutagenized populations for mutants that show early GPA while been sterile, as a starting point to the identification of factors potentially involved in the signalling mechanism between developing seeds and the apical meristem, one the proposed pathways for GPA regulation. In the third chapter, we have developed several biotechnological strategies to increase the production of fruits and seeds in Arabidopsis thaliana. These strategies aim to apply the knowledge we have gained about the FUL-AP2 pathway for the control of meristem activity to delay GPA. All the strategies converge in increasing AP2 expression specifically in the SAM. For this, specific promoters of this tissue have been used to either to silence FUL or to impair miR172 activity. Through these strategies, we have achieved to increase fruit production in Arabidopsis up to 40%. Finally, in the fourth chapter we have analysed the functional conservation of FUL in Pisum sativum. After the characterization of the fula and fulb mutants, we have observed that in fulb mutant, GPA is delayed, increasing the production of reproductive nodes and therefore of pods without any additional developmental defects. Our results show the conservation of FUL role in GPA regulation between brassica and legumes.

El desarrollo de todos los órganos de la planta depende de la actividad de los meristemos y regiones adyacentes. Las plantas monocárpicas presentan un único ciclo reproductivo antes de su senescencia y muerte. La senescencia y muerte de estas plantas está precedida por una parada global de la proliferación de sus meristemos (GPA). De este modo, el número de flores/frutos que producen durante su vida depende de la actividad proliferativa de los meristemos apicales de las ramas y de cuando se produzca el GPA. El estudio de los mecanismos que controlan el GPA, así como un mayor conocimiento de los genes implicados en el mantenimiento de las células meristemáticas durante este proceso, proporcionaría herramientas muy útiles en los programas de mejora de cultivos para la obtención de variedades más productivas. EL GPA es un fenómeno descrito hace más de un siglo para varias plantas monocárpicas, y se han planteado diferentes hipótesis sobre los factores que lo desencadenan. Entre los factores propuestos se encuentran la existencia de relaciones fuente-sumidero o la regulación de la actividad meristemática por parte de los órganos reproductivos en desarrollo. Respecto al papel de los órganos reproductivos está bien definido un papel señalizador de las semillas en desarrollo, ya que la esterilidad de la planta o la poda de los frutos retrasan considerablemente el GPA. Por otro lado, en nuestro grupo se ha desvelado recientemente la que es probablemente la primera ruta genética propuesta de regulación de la longevidad del meristemo en plantas monocárpicas, y que incluye a los factores transcripcionales FRUITFULL (FUL) y APETALA2 (AP2) en el control temporal de este proceso en Arabidopsis thaliana. Esta ruta propone que con la edad los niveles de expresión del miR172 y de FUL aumentan como consecuencia de la reducción del miR156 y aumento de los factores de transcripción SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPLs), que regulan la expresión de FUL. El aumento de la expresión de FUL y del miR172 produce la reducción de los niveles de AP2, que ocasiona la progresiva disminución de la expresión del gen de mantenimiento meristemático WUSCHEL (WUS), y por tanto, el cese de la actividad meristemática y aparición del GPA. En el capítulo 1 de esta tesis doctoral se ha pretendido profundizar en el estudio del control de la longevidad de los meristemos mediante la ruta FUL-AP2, identificando dianas moleculares o interactores de AP2. En el capítulo 2 hemos llevado a cabo el rastreo de diferentes poblaciones mutagenizadas buscando mutantes que a pesar de ser estériles tuvieran un GPA temprano, como punto de partida a la identificación de factores implicados en la vía de señalización entre semillas en desarrollo y meristemo apical, otra de las posibles rutas de regulación del GPA. En el capítulo 3 hemos desarrollado una serie de estrategias biotecnológicas que permiten aumentar la producción de frutos y semillas en Arabidopsis thaliana. Estas estrategias tratan de aplicar el conocimiento sobre la ruta FUL-AP2 de mantenimiento de la actividad meristemática para retrasar el GPA. Todas las estrategias convergen en elevar el nivel de expresión de AP2 únicamente en el SAM. Para ello, se han empleado promotores específicos de este tejido, dirigiendo el silenciamiento de FUL o la desregulación de la actividad del miR172. Mediante estas estrategias hemos conseguido incrementar la producción de frutos en la inflorescencia principal de Arabidopsis hasta en un 40%. Por último en el capítulo 4 hemos analizado la conservación funcional de FUL en Pisum sativum. Tras la caracterización de los mutantes fula y fulb, observamos como en el mutante fulb se retrasa el GPA, incrementando la producción de nudos reproductivos, y por tanto de vainas sin que estas muestren defectos en su desarrollo. Los resultados obtenidos indican una clara conservación del papel de FUL en el GPA entre brásicas y leguminosas.

El desenvolupament de tots els òrgans de la planta depèn de l'activitat dels meristems i regions adjacents. Les plantes monocàrpiques presenten un únic cicle reproductiu abans de la seua senescència i mort. La senescència i mort d'aquestes plantes està precedida per una parada global de la proliferació dels seus meristems (GPA). D'aquesta manera, el nombre de flors/fruits que produeixen durant la seua vida depèn de l'activitat proliferativa del meristem apical de la tija i de quan es produeix el GPA. L'estudi dels mecanismes que controlen el GPA, així com un major coneixement dels gens implicats al manteniment de les cèl·lules meristemàtiques durant aquest procés, proporcionaria eines molt útils en els programes de millora de cultius per a l'obtenció de varietats més productives. EL GPA és un fenomen descrit fa més d'un segle per a diverses plantes monocàrpiques, i s'han plantejat diferents hipòtesis sobre els factors que el desencadenen. Entre els factors proposats es troben l'existència de relacions font-sumider o la regulació de l'activitat meristemàtica per part dels òrgans reproductius en desenvolupament. Pel que fa al paper dels òrgans reproductius està ben definit un paper senyalitzador de les llavors en desenvolupament, ja que l'esterilitat de la planta o la poda dels fruits retarda considerablement el GPA. D'altra banda, en el nostre laboratori s'ha revelat recentment la que és probablement la primera ruta genètica proposta de regulació de la longevitat del meristem en plantes monocàrpiques, i que inclou els factors transcripcionals FRUITFULL (FUL) i APETALA2 (AP2) en el control temporal d'aquest procés en Arabidopsis thaliana. Aquesta ruta proposa que amb l'edat els nivells d'expressió del miR172 i de FUL augmenten com a conseqüència de la reducció del miR156 i augment dels factors de transcripció SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPLs), que regulen l'expressió de FUL. L'augment de l'expressió de FUL i del miR172 produeix la reducció dels nivells de AP2, que ocasiona la progressiva disminució de l'expressió del gen de manteniment meristemàtic WUSCHEL (WUS), i per tant, el cessament de l'activitat meristemàtica i aparició del GPA. En el capítol 1 d'aquesta tesi doctoral s'ha pretès aprofundir en l'estudi del control de la longevitat dels meristems mitjançant la ruta FUL-AP2, identificant dianes moleculars o interactors de AP2. En el capítol 2 hem dut a terme el rastreig de diferents poblacions mutageneizadas buscant mutants que tot i ser estèrils tingueren un GPA temprà, com a punt de partida a la identificació de factors implicats en la via de senyalització entre llavors en desenvolupament i meristem apical, una altra de les possibles rutes de regulació del GPA. En el capítol 3 hem desenvolupat una serie d'estratègies biotecnològiques que permeten augmentar la producció de fruits i llavors en Arabidopsis thaliana. Aquestes estratègies intenten aplicar el coneixement sobre la ruta FUL-AP2 de manteniment de l'activitat meristemàtica per retardar el GPA. Totes les estratègies convergeixen en elevar el nivell d'expressió de AP2 únicament en el SAM. Per açò, s'han emprat promotors específics d'aquest teixit, dirigint el silenciament de FUL o la desregulació de l'activitat del miR172. Mitjançant aquestes estratègies hem aconseguit incrementar la producció de fruits en la inflorescència principal d'Arabidopsis fins un 40%. Finalment en el capítol 4 hem analitzat la conservació funcional de FUL en Pisum sativum. Després de la caracterització dels mutants fula i fulb, observarem com en el mutant fulb es retardava el GPA, incrementant la producció de nusos reproductius, i per tant de baines, sense que aquestes mostraren defectes en el seu desenvolupament. Els resultats obtinguts indiquen una clara conservació del paper de FUL al GPA entre brasicas i lleguminoses.