Función del motivo Walker A en la conformación de NLRP3 durante su activación

Abstract

Inflammation is the host response to microbial infection or sterile damage that aims to resolve the infection, repair tissue damage, and restore homeostasis. Inflammasomes are key signaling molecular platforms inducing and maintaining the inflammatory response by inducing the release of different active proinflammatory cytokines, as interleukin (IL)-1β or IL-18. Inflammasomes are typically the result of the cytosolic oligomerization of an intracellular nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat receptor (NLR) upon macrophage activation with different pathogenic or endogenous danger signals. Mutations in one of the most studied NLRs, the NLRP3 protein, results in a gain-of-function and the auto-inflammatory diseases called cryopyrin-associated periodic syndromes (CAPS). NLRs possess an ATPase activity and contain a series of conserved residues responsible for both ATP binding and hydrolysis. Walker A motif is crucial for ATP binding and its mutation in NLRP3 disrupt the activity of this protein, indicating a critical role of ATP binding and hydrolysis in the regulation of NLRP3 inflammasome activation. The general hypothesis of this Master Thesis is to explore the effect of the change of the Walker A motif amino acids (p.G301A, p.K302A, p.T303A) in both the wild-type NLRP3 protein and the CAPS-associated NLRP3 mutant p.D303N and how they affect to the conformational changes of NLRP3 during activation and inhibition. The methodology mainly used in this work is the bioluminescent resonance energy transfer (BRET) technique, which is based in a natural phenomenon resulting from a non-radiative energy transfer between a bioluminescent donor (Renilla luciferase) and a fluorescent protein acceptor. BRET signal is dependent on the distance and the orientation between the donor and the acceptor and could be used to study conformational changes within proteins in real time in living cells. Previous study of the BRET signal in both wild-type NLRP3 and NLRP3 p.D303N in the laboratory of Dr. Pablo Pelegrín has allowed to define a characteristic pattern of both proteins in basal conditions, as well as the conformational changes during activation, using nigericin, or inhibition by the specific NLRP3 inhibitor MCC950. The objective of this work is to determine, in terms of BRET signal, the conformational changes of both NLRP3 and NLRP3 p.D303N with the mutated Walker A motif. We will also complement the BRET results with fluorescence microscopy to address the oligomerization status of Walker A NLRP3 mutants, to provide additional data on the functionality of these proteins. Thus, it is intended to clarify the role of ATP binding, both in the initial conformation of NLRP3 and NLRP3 p.D303N and during its activation by nigericin or MCC950 inhibition

La inflamación es la respuesta del huésped ante una infección microbiana o a señales de daño endógenas que tiene como objetivo resolver la infección, reparar el daño tisular y restaurar la homeostasis. Los inflamasomas son unas plataformas de señalización clave para inducir y mantener la respuesta inflamatoria mediante la liberación de citocinas proinflamatorias como la interleucina (IL)-1β o la IL-18. Normalmente, los inflamasomas son el resultado de la oligomerización intracelular de un receptor citosólico tipo nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing family (NLR) tras la activación del macrófago ante diferentes señales de peligro patogénicas o endógenas. Mutaciones en uno de los NLRs más estudiados, la proteína NLRP3, dan lugar a una ganancia de función y una serie de enfermedades autoinflamatorias denominadas síndromes periódicos asociados a criopirina (CAPS, del inglés Cryopyrin-associated periodic syndromes). Los NLRs poseen actividad ATPasa y contienen una serie de residuos conservados encargados tanto de la unión como de la hidrólisis de ATP. El motivo Walker A es crucial para la unión del ATP y se ha demostrado que su mutación en NLPR3 es capaz de causar la disrupción de la actividad de esta proteína, lo que parece indicar un papel esencial de la unión e hidrólisis del ATP en la regulación de la activación de este inflamasoma. La hipótesis de este Trabajo Fin de Máster es explorar el efecto del cambio de residuos clave en el motivo Walker A (p.G301A, p.K302A, p.T303A), que impiden la unión del ATP tanto en la proteína silvestre como en la variante asociada a CAPS p.D303N y cómo éstos afectan a los cambios conformacionales de NLRP3 durante su activación e inhibición La metodología usada se sustenta principalmente en la técnica de transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET, del inglés bioluminescence resonance energy transfer), la cual se basa en un fenómeno natural de transferencia energética entre un donante bioluminiscente (luciferasa de Renilla) y una proteína fluorescente aceptora. La señal de BRET es dependiente de la distancia y la orientación entre el donante y el aceptor y puede usarse para estudiar cambios conformacionales dentro de una misma proteína en células a tiempo real. El estudio previo de la señal de BRET tanto de NLRP3 silvestre como NLRP3 p.D303N en el laboratorio del Dr. Pablo Pelegrín ha permitido definir un patrón característico de ambas proteínas en condiciones basales, así como monotorizar los cambios conformacionales producidos en respuesta a diferentes activadores, como es el caso de la nigericina, e inhibidores, como el MCC950. El objetivo de este trabajo es determinar el cambio conformacional de NLRP3, en términos de señal de BRET, tanto de la proteína silvestre como de p.D303N, ambos con el motivo Walker A mutado. Por otra parte, los datos de BRET se complementarán mediante microscopía de fluorescencia para comprobar el estado de oligomerización de ambos mutantes, con el objetivo de aportar datos adicionales sobre la funcionalidad de estas proteínas. De este modo, se pretende esclarecer la función de la unión de ATP a NLRP3 sobre la conformación inicial de NLRP3 silvestre y p.D303N y sobre los cambios conformacionales tras su activación con nigericina o su inhibición con MCC950.