Diseño de entornos tridimensionales para el cultivo de células madre mesenquimales

Abstract

[ES] La expansión y diferenciación de las células madre mesenquimales supone uno de los pasos clave dentro de las terapias enfocadas a la regeneración de tejido con técnicas de ingeniería tisular. Este trabajo busca combinar las ventajas de los materiales sintéticos y naturales para desarrollar busca desarrollar medios de cultivo tridimensionales en los que las células encuentren superficies adherentes y, por otra parte, puedan desarrollar interacciones célula¿célula en tres dimensiones. Así, los medios de medios de cultivos estarán basados en micropartículas poliméricas de un polisacárido con otras de un poliéster biodegradable, que tendrán unos rangos de tamaños reproducibles a nivel celular para guiarla diferenciación in vitro de células madre mesenquimales (MSCs). Para el desarrollo del sistema de cultivo 3D, se han evaluado y optimizado los métodos de fabricación de las micropartículas, obteniendo, por un lado, microesferas de ácido poliláctico en un rango de tamaños 150-200 µm, que proporcionan una superficie lo suficientemente rígida y químicamente compatible para permitir la adhesión celular, y por otro lado, microesferas de quitosano de tamaños equivalentes. Además de la fabricación de las microesferas, se ha analizado y caracterizado sus estructuras mediante lupa binocular y microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FESEM), sus propiedades mecánicas mediante un ensayo de compresión confinada, así como el grado de hinchado en el caso de las esferas de quitosano. En lo relativo a la caracterización biológica, se han llevado a cabo ensayos biológicos con células madre mesenquimales de médula ósea porcinas en tres entornos tridimensionales de cultivo distintos, basados en microesferas de PLLA, microesferas de CHT y mezcla de ambos materiales, respectivamente, con el objetivo de caracterizar la viabilidad, proliferación y diferenciación celular con los sistemas materiales desarrollados.

[EN] The expansion and differentiation of mesenchymal stem cells is one of the key aspects within therapies focused on the regeneration of tissue with tissue engineering techniques. This work seeks to combine the advantages of synthetic and natural materials to develop three-dimensional culture environment in which the cells find adherent surfaces and, on the other hand, can develop cell-cell interactions in three dimensions. Thus, the culture system will be based on polymer microparticles of a polysaccharide with others of a biodegradable polyester, which will have a range of cell-level reproducible sizes to guide in vitro differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). For the development of the 3D culture system, the microparticle manufacturing methods have been evaluated and optimized, obtaining, on the one hand, polylactic acid microspheres in a size range 150-200 ¿m, which provide a sufficiently rigid surface and chemically compatible to allow cell adhesion and, on the other hand, chitosan microspheres of equivalent sizes. In addition to the manufacture of the microspheres, their structures have been analyzed and characterized by stereoscopic microscope and field scanning electron microscopy (FESEM), their mechanical properties by means of a confined compression test, as well as the degree of swelling in the case of the chitosan spheres. Regarding to biological characterization, biological assays with porcine bone marrow mesenchymal stem cells were carried out in three different three-dimensional culture environments, based on PLLA microspheres, CHT microspheres and mixing of both materials, respectively, with the objective of characterizing cell viability, proliferation and differentiation with developed material systems.