Estudios sobre regeneración y transformación genética en pepino (Cucumis sativus L) vía Agrobacterium tumefaciens

Abstract

Cucumber is one of the most important horticultural species at economic level. Despite its agronomic relevance, there is currently no efficient transformation method available. The problems to obtain transgenic cucumber plants are mainly due to the low morphogenetic response in explants of certain genotypes, poor adequacy of selection methods, decrease in regeneration rate as a consequence of the usual treatments in a transformation experiment and, above all, the high rate of 'escape' plants. Taking into account the existing problems, the first objective of the present work has been the evaluation of the morphogenetic response in cucumber explants and the development of regeneration methods potentially useful in transformation experiments. These studies have been carried out with two commercial cultivars, four pure lines and one line that has been frequently used in cucumber breeding programs. Different types of primary explants have been evaluated to determine which may be the most suitable in a transformation experiment. The influence of the ontogenic state of the seedling on the degree of myxoploidy in cotyledon explants has been studied. Likewise, the ploidy level of regenerated plants from these explants has been determined. Regarding the culture medium, the effect of growth regulators, as well as that of other components, such as silver nitrate or copper sulphate, has been studied. In the context of the second objective, studies on the different stages of the transformation process by co-cultivation of cucumber explants with Agrobacterium tumefaciens have been carried out. Several factors, such as the Agrobacterium strain, how to carry out the phases of inoculation and co-culture, the suitability of different marker genes in the selection process and the influence of different components of the culture medium have been analyzed. Attempts have also been made to infer the causes of the occurrence of 'escape' plants or the formation of chimeras in cucumber transformation experiments. Finally, based on the results obtained, some solutions that could help to avoid this problem in future experiments are proposed.

El pepino es una de las especies hortícolas más importantes a nivel económico. Pese a su relevancia agronómica, no puede decirse que a día de hoy se disponga de un método de transformación adecuado. Los problemas a la hora de conseguir plantas transgénicas de pepino estriban en la baja respuesta morfogenética en explantes de ciertos genotipos, la escasa adecuación de los métodos de selección, el descenso en la tasa de regeneración debido a los tratamientos habituales en un experimento de transformación y, sobre todo, la alta tasa de escapes. En función de la problemática existente, el primer objetivo del presente trabajo ha sido la evaluación de la respuesta morfogenética en explantes de pepino y el desarrollo de métodos de regeneración potencialmente útiles en experimentos de transformación. Estos estudios se han llevado a cabo con dos cultivares comerciales, cuatro líneas puras y una línea que ha sido utilizada frecuentemente en programas de mejora genética de pepino. Se han empleado distintos tipos de explantes primarios para determinar cuál o cuáles pueden ser los más adecuados en un experimento de transformación. Se ha estudiado la influencia del estado ontogénico de la plántula sobre el grado de mixoploidía en explantes de cotiledón. Asimismo, se ha determinado el nivel de ploidía de las plantas regeneradas a partir de estos explantes. Por lo que respecta al medio de cultivo, además de estudiar el efecto de componentes habituales (e.g. reguladores del crecimiento) se ha evaluado el de otros que no lo son tanto, como el nitrato de plata o el sulfato de cobre. En el contexto del segundo objetivo se han realizado una serie de estudios sobre las etapas del proceso de transformación mediante co-cultivo de explantes de pepino con Agrobacterium tumefaciens. Se han analizado diversos factores, tales como la cepa de Agrobacterium, la forma de llevar a cabo las fases de inoculación y co-cultivo, la adecuación de distintos genes marcadores en el proceso de selección y la influencia de distintos componentes del medio de cultivo. Asimismo, se han tratado de inferir las causas que generan la aparición de escapes o de quimeras en experimentos de transformación de pepino. Por último, sobre la base de los resultados obtenidos, se proponen algunas soluciones que podrían ayudar a evitar este problema en futuros experimentos.

El cogombre és una de les espècies hortícoles més importants a nivell econòmic. A pesar de la seua rellevància agronòmica, no pot dir-se que a hores d'ara es dispose d'un mètode de transformació adequat. Els problemes a l'hora d'aconseguir plantes transgèniques de cogombre consistixen en la baixa resposta morfogenètica en explants de certs genotips, l'escassa adequació dels mètodes de selecció, el descens en la taxa de regeneració degut als tractaments habituals en un experiment de transformació i, sobretot, l'alta taxa de fugues. En funció de la problemàtica existent, el primer objectiu del present treball ha sigut l'avaluació de la resposta en explants de cogombre i el desenvolupament de mètodes de regeneració potencialment útils en experiments de transformació. Estos estudis s'han dut a terme amb dos cultivars comercials de cogombre, tres línies pures i una línia que ha servit de base en programes de millora. S'han empleat distints tipus d'explants primaris per a determinar quin o quins poden ser els més adequats en un experiment de transformació. Pel que fa al mig de cultiu, a més d'estudiar l'efecte de components habituals (e.g. reguladors del creixement) s'ha avaluat el d'altres que no ho són tant, com el nitrat de planta o el sulfat de coure. Així mateix, s'ha analitzat el grau de mixoploidia en alguns explants i l'efecte de certs tractaments sobre el nivell de ploidia de les plantes regenerades. En el context del segon objectiu s'han realitzat una sèrie d'estudis sobre les etapes del procés de transformació per mitjà de co-cultiu d'explants de cogombre amb Agrobacterium tumefaciens. S'han analitzat diversos factors, com ara el cep d'Agrobacterium, la forma de dur a terme les fases d'inoculació i co-cultiu, l'adequació de distints gens marcadors en el procés de selecció i la influència de distints components del mig de cultiu. Així mateix, s'han tractat d'inferir les causes que generen l'aparició de plantes no transgèniques (escape plants) o de quimeres en experiments de transformació de cogombre. Finalment, sobre la base dels resultats obtinguts es plantegen algunes solucions que ajuden a evitar estos problemes en futurs experiments.