Estudio preliminar de las interacciones del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) y su huésped

Abstract

Citrus tristeza virus (CTV) is a viral species of the Closterovirus genus, having a ¿20 kb single-stranded and positive sense genomic RNA (gRNA) organized into 12 open reading frames (ORFs) potentially coding 17 protein products, some of which of unknown function. CTV proteins p25 and p27 belong to a gene block involved in virion assembly. It has been demonstrated that p25, along with p20 and p23, are RNA silencing suppressors in some species of Nicotiana, being the latter a pathogenesis determinant. CTV host range is very restricted and in nature viral infections are limited to the phloem cells of some citrus species. Consequently, working with this virus-host pathosystem requires an appropriate experimental host and an efficient CTV genetic system. In our laboratory we have developed a new CTV genetic system based on the agroinfection of Nicotiana benthamiana plants, a non-natural host, with infectious clones of the T36 isolate. That infection induces characteristic symptoms, some of which correlate with those caused by the virus in citrus plants. CTV-N. benthamiana interactions are very variable and genotype-dependent, so only some isolates can replicate in this species and T36 is unique causing systemic infections. In this work, we studied the function of CTV p20 and p25 proteins from three different isolates differing in its pathogenic characteristics. Transient expression of p20 and p25 fused to fluorescent proteins showed an identical subcellular localization for both N. benthamiana and citrus. The p20 protein of T36, T318A and T385 isolates localized in cytoplasm and nucleus forming amorphous aggregates associated with perinuclear regions, together with nuclear punctuate inclusions. On the other hand, subcellular localization of p25 differed depending on the CTV isolate. While p25 of T36 and T385 localized in the nucleus, that of T318A did it in cytoplasm. A detailed analysis of the protein regions involved in this subcellular localization unveiled a leucine-rich nuclear export signal (NES) in the N-terminus (Nt) of the protein. The pathogenic ability of CTV p20 and p25 in N. benthamiana was tested through a PVX heterologous viral infection, showing that p25 was not a pathogenicity determinant in this species, albeit p20 it was. Besides, the interactome of p25-T36 was more complex and diverse than that of p25-T318A, involving a greater number of metabolic processes, redox activities, homeostasis and cellular transport, biosynthesis and protein degradation, plastid and nucleic acid protein binding, biotic and oxidative stress, jasmonic-mediated defense, methylation, ROS signalling and HSP proteins. On the other hand, most p25-T318A potential interactors were related to transport/localization and stress response, like apoptosis, pathogenesis-related and HSP proteins, Ca+2-binding proteins and redoxins. Moreover, the experimental evolution of CTV in N. bethamiana was achieved through serial passages. The evolution process showed adaptative traits as the increase of graft survival, infectivity rates and viral titers, and a decreased time for the onset of symptom development in this species. Adaptive characteristics of evolved viral populations in N. bethamiana, were also correlated to their genetic variability and population structure. Two different evolved lineages showed convergent evolution processes reflected also at the molecular level. CTV viruses evolved in N. benthamiana were found to be less infectious at initial stages of infection when they were back-inoculated to citrus plants, and showed a decreased viral titer during the first year post-inoculation. This re-adaptation of N. benthamiana viral populations back to citrus was correlated, at a molecular level, with the progressive loss of the mutations appeared during its evolution process in N. benthamiana.

El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) es un closterovirus con un RNA genómico (gRNA) de ssRNA (+) y ¿20 Kb organizado en 12 pautas de lectura abierta (ORFs) que codifican al menos 17 proteínas, algunas de función desconocida. Las proteínas p25 y p27 forman parte de un grupo de genes implicados en el ensamblaje del virión, y se ha demostrado que p25 junto con p20 y p23 son supresores de silenciamiento génico en algunas especies de Nicotiana, y la última es también un determinante de patogénesis. CTV tiene una gama de huéspedes muy restringida y de forma natural sólo infecta el floema de algunas especies de cítricos. Por ello, para trabajar con este patosistema virus-huésped, se requiere un huésped experimental adecuado y un sistema genético eficiente de CTV. Durante los últimos años hemos desarrollado un sistema genético de CTV basado en la agroinfección sistémica de Nicotiana benthamiana, una especie no-natural de este virus, con clones infecciosos del genotipo T36. Dicha infección va acompañada de síntomas característicos, algunos de los cuales son similares a los que el virus induce en cítricos. La interacción CTV-N. benthamiana es muy variable y genotipo-dependiente, sólo algunos aislados se replican en esta especie y únicamente T36 la infecta sistémicamente. En este trabajo, abordamos la función de las proteínas p20 y p25 de tres aislados de CTV que difieren en sus características patogénicas. La expresión transitoria de las p20 y p25 fusionadas a proteínas fluorescentes reveló su idéntica localización subcelular en N. benthamiana y cítricos. La proteína p20 se localizó en el citosol y el núcleo celular en agregados amorfos asociados a regiones perinucleares e inclusiones nucleares puntuales. En cambio, la expresión de la p25 de T36, T318A y T385 de CTV reveló una localización diferencial. Mientras la de T36 y T385 fue nuclear, la de T318A fue citosólica. Un análisis detallado de las regiones implicadas en dicha localización, reveló la existencia de una señal de exportación nuclear NES rica en leucinas en la región Nt de la proteína. Un análisis de la capacidad patogénica de p20 y p25 en N. benthamiana en un contexto de infección viral heterólogo a través de PVX, mostró que p25 no es un determinante de patogenicidad en esta especie, pero p20 sí. Por otra parte, el interactoma de la p25-T36 resultó mucho más complejo y diverso que el de la p25-T318A, interviniendo potencialmente en mayor número de procesos metabólicos de fotosíntesis, actividad redox, homeóstasis y transporte celular, biosíntesis y degradación de proteínas, unión a proteínas de los plastidios y ácidos nucleicos o de respuesta a estrés (biótico y oxidativo) o defensa mediada por la ruta del jasmónico, del ciclo de metilación, señalización por ROS y proteínas HSP. Las interacciones mayoritarias de la p25-T318A se relacionaron con transporte/localización y respuesta a estrés, principalmente con interactores implicados en procesos de apoptosis, patogénenis y proteínas HSP, de unión a calcio o redoxinas. También hemos conseguido la evolución experimental de CTV por pases seriados en N. benthamiana. Dicha evolución conlleva un conjunto de características adaptativas significativas como: el aumento del prendimiento de injertos, de la tasa neta de infectividad, del título viral y del adelanto de los síntomas causados en esta especie herbácea con el aumento de los pases. Las características adaptativas también se reflejaron a nivel molecular en la variabilidad genética y estructura de las poblaciones de los virus evolucionados en dos linajes independientes. Virus evolucionados en N. benthamiana resultaron menos infecciosos inicialmente por inoculación mecánica de regreso a cítricos, y se acumularon menos que el virus parental durante el primer año. Dicha re-adaptación de los virus evolucionados se reflejó a nivel molecular en la pérdida progresiva de las m

El virus de la tristesa dels cítrics (CTV) és un closterovirus amb un RNA genòmic de ssRNA(+) i 20 Kb organitzat en 12 pautes de lectura oberta (ORFs) que codifiquen, al menys, 17 proteïnes, algunes de les quals de funció desconeguda. Les proteïnes p25 i p27 formen part d'un grup de gens implicat en l'assemblatge del virió, i s'ha demostrat que p25, junt a p20 i p23, són supressors de silenciament gènic en algunes espècies de Nicotiana, i la última també és un determinant de patogènesi. La gama d'hostes de CTV és molt restringida i de forma natural sols infecta el floema d'algunes espècies de cítrics. Per això, per a treballar amb aquest patosistema virus-hoste, es requereix un hoste experimental adequat i un sistema genètic eficient de CTV. Durant els últims anys hem desenvolupat un sistema genètic de CTV basat en l'agroinfecció sistèmica de Nicotiana benthamiana, una espècie no-natural d'aquest virus, amb clons infecciosos del genotip T36. Aquesta infecció va acompanyada de símptomes característics, alguns dels quals són similars als que el virus indueix en cítrics. La interacció CTV-N. benthamiana és molt variable i genotip depenent, ja que sols alguns aïllats es repliquen en aquesta espècie i únicament T36 la infecta sistèmicament. En aquest treball hem abordat la funció de les proteïnes p20 i p25 de tres aïllats de CTV que difereixen en les seues característiques patogèniques. L'expressió transitòria de les p20 i p25 fusionades a proteïnes fluorescents va revelar la seua idèntica localització subcel·lular en N. benthamiana i cítrics. La proteïna p20 dels aïllats T36, T318A i T385 es va localitzar al citosol i al nucli cel·lular formant agregats amorfs associats a regions perinuclears, i inclusions nuclears puntuals. En canvi, l'expressió de la p25 de T36, T318A i T385 de CTV va revelar una localització diferencial. Mentre la de T36 i T385 fou nuclear, la de T318A fou citosòlica. Una anàlisi detallada de les regions implicades en eixa localització va revelar l'existència d'una senyal d'exportació nuclear (NES) rica en leucines a la regió Nt de la proteïna. L'anàlisi de la capacitat patogènica de p20 i p25 en N. benthamiana en un context d'infecció viral heteròloga a través de PVX, va mostrar que p25 no és un determinant de patogenicitat en aquesta espècie, però p20 sí. D'altra banda, l'interactoma de p25-T36 va resultar molt més complex i divers que el de p25-T318A, intervenint potencialment en un major nombre de processos metabòlics de fotosíntesi, activitat redox, homeòstasi i transport cel·lular, biosíntesi i degradació de proteïnes, unió a proteïnes dels plastidis i àcids nucleics o de resposta a estrés (biòtic i oxidatiu) o defensa mediada per la ruta del jasmònic, del cicle de metilació, senyalització per ROS i proteïnes HSP. Les interaccions majoritàries de la p25-T318A es relacionaren amb transport/localització i resposta a estrés, principalment amb interactors implicats en processos d'apoptosi, patogènesi i proteïnes HSP, d'unió a calci o redoxines. També hem aconseguit l'evolució experimental de CTV per passes seriats en N. benthamiana. Aquesta evolució comporta un conjunt de característiques adaptatives significatives com: l'augment de la supervivència dels empelts, de la taxa neta d'infectivitat, de la càrrega viral i de l'ajornament dels símptomes causats en aquesta espècie herbàcia amb l'augment dels passes. Les característiques adaptatives també es reflectiren a nivell molecular amb la variabilitat genètica i estructura de les poblacions dels virus evolucionats en dos llinatges independents. Virus evolucionats a N. benthamiana resultaren menys infecciosos inicialment per inoculació mecànica de tornada a cítrics, i s'acumularen menys que el virus parental durant el primer any. Aquesta re-adaptació dels virus evolucionats a N. benthamiana de tornada a cítrics es va reflectir a nivell molecular amb