Optimización de un sistema de transporte de RNA al cloroplasto para la expresión heteróloga de proteínas

Abstract

[EN] Chloroplast transgenesis is an emerging approach for the production of heterologous proteins. However, it is limited by the necessity of genomic sequence knowledge and the lengthy procedures required for obtaining a homo-plastid configuration, among others. That constrains could be avoided with an expression system based on specific RNA traffic to the chloroplast. In the present study, an expression cassette based on a viroid-derived sequence as targeting signal, was attempted to optimize by increasing protein expression levels and reducing biosafety concerns. Influence of several 5’ untranslated leader sequences in protein expression levels was analysed. Additionally, the viroid-derived sequence was reduced in two shorter versions and a sequence with an analogous secondary structure was also designed. These variants did not present protein accumulation in the chloroplast despite that correspondent RNAs were presumably detected in the organelle. According to our results, the RNA targeting signal encodes a putative chloroplast transport peptide which is translated from a non-canonical start. Finally, 5’ untranslated chloroplastic translation enhancers were not suitable for transient expression because of the early expression in Agrobacterium tumefaciens.

Sistemas animales y procariotas permiten la producción de proteínas heterólogas. No obstante, suelen concurrir en determinantes que condicionan su uso masivo. En este escenario, la transgénesis de cloroplastos transplantómica (transplantómica) emerge como un sistema alternativo para la producción de proteínas heterólogas. El alto número de genomas cloroplásticos por célula, sumado a la inexistencia en estos orgánulos de regulación negativa por silenciamiento, permiten expresar genes foráneos a niveles extraordinariamente altos (Bock, 2015). Además, la predominancia de la herencia cloroplástica materna minimiza el riesgo de dispersión del transgen por polen, convirtiendo a la transplantómica en una tecnología ecológicamente segura. Desafortunadamente la transformación cloroplástica se basa en recombinación homóloga de secuencia, lo que genera dos condicionantes (a- necesidad de conocimiento de la secuencia del genoma y b- construcciones específicas de genoma) responsables de que actualmente la transplantómica sea solo viable en un reducido número de especies. Por esto, es necesario el desarrollo de estrategias innovadoras que simplifiquen y universalicen la expresión de genes foráneos en cloroplastos (Day &Goldschmidt, 2011). En los últimos años, el grupo donde se va a realizar este TFM ha demostrado la existencia en plantas de una vía de transporte núcleo-cloroplastos, en la que un RNA no-codificante (nc-RNA) funciona como señal capaz de regular la expresión de proteínas codificadas en núcleo en este orgánulo (Gomez& Pallas, 2010). Este descubrimiento abre la puerta al desarrollo de técnicas de expresión de compuestos en cloroplastos inimaginables hasta este momento (Gomez& Pallas, 2012 a y b).

Por tanto, el objetivo central de este trabajo consiste en incrementar el potencial productivo del sistema de señalización cloroplástica mediado por ncRNAs como herramienta biotecnológica. Para ello hemos diseñado una serie de objetivos particulares que constituyen el esquema básico de nuestro plan de trabajo.

-Identificar y caracterizar la estructura del dominio de ncRNA-viroidal implicado en el proceso de señalización núcleo-cloroplasto

-Diseñar un nc-RNA con una secuencia que no sea reconocida como propia del viroide, capaz de adquirir una estructura análoga a la del dominio de señalización que mantenga su actividad funcional.

-Incluir en el extremo 5¿ UTR dominios que hagan más eficiente la traducción de las proteínas en el cloroplasto. Bibliografía: - Bock R. (2015) AnnuRevPlant Biol. 66:211-241. - Day A. and Goldschmidt M. (2011)PlantBiotechnol J. 9(5):540-553. - Gómez G. &Pallás V. (2010) PLoSOne 5 (8), e12269 - Gómez G. &Pallás V.(2012 a) PlantPhysiology 159 (2), 558-564. - Gómez G. &Pallás V.(2012 b) Plantsignaling&behavior 7 (7), 882-884