Desarrollo y aplicación de técnicas biotecnológicas para el saneamiento, multiplicación, caracterización y conservación de germoplasma de vid (Vitis vinifera L.)

Abstract

La vid es un cultivo de propagación vegetativa y de gran importancia económica cuyo cultivo se distribuye mundialmente por zonas templadas. Su producción va destinada principalmente a la elaboración de vino, seguido de la producción de uva de mesa. Aunque existen miles de variedades, una decena de ellas son las que se utilizan mayoritariamente a nivel mundial lo que conlleva a una pérdida de variabilidad. Desde la llegada de la filoxera, el cultivo de la vid se realiza mediante injerto en pies resistentes a este áfido. Según la Comisión Directiva 2005/43/EC el material de propagación de vid debe estar libre de los siguientes virus: GFLV, GLRaV-1, GLRaV-3, GFkV y ArMV. En este trabajo se han evaluado y desarrollado distintas metodologías relacionadas con el cultivo in vitro de plantas encaminadas al saneamiento, multiplicación y conservación de germoplasma de vid. La conservación de variedades de vid in vitro es muy importante para complementar la conservación de germoplasma de las colecciones de campo. Para ello es importante seleccionar el material a conservar, determinar su estado sanitario, sanear si es el caso y establecer las condiciones adecuadas para su conservación. En un primer capítulo de esta tesis (Capítulo 1) se describen los ensayos realizados para inducir la embriogénesis somática en 16 variedades de vid que incluyen seis variedades infectadas con los virus GFLV, GLRaV-3 y GFkV. La embriogénesis somática ha sido descrita en vid como una metodología útil para el saneamiento de plantas infectadas con virus y es la vía común de regeneración adventicia.. En este trabajo se utiliza como material de partida semillas cortadas y se han obtenido plantas libres de virus y porcentajes de regeneración elevados en todas las variedades evaluadas. La utilización de marcadores microsatélites nos ha servido para seleccionar entre las plantas regeneradas aquellas que muestran el mismo genotipo que las plantas de partida. Por otra parte, en este trabajo se ha desarrollado un protocolo de micropropagación a partir de planta sana de la variedad 'Monastrell' cultivada in vitro obteniéndose tasas de multiplicación elevadas y plantas que se han aclimatado a condiciones de campo (Capítulo 2). El medio de cultivo MW, utilizado para el desarrollo de las plantas, se ha evaluado en otras 16 variedades y también se ha comparado el crecimiento en este medio y en variaciones de éste, como son la disminución de la concentración de azúcar a la mitad y la eliminación del ácido indolbutírico. La finalidad de estos ensayos ha sido determinar para cada variedad qué condiciones son las más adecuadas para mantener el germoplasma vegetal en cultivo in vitro activo, pero alargando el tiempo entre subcultivos optimizando costes (Capítulo 3). En el Capítulo 4 se incluye un trabajo para localizar, identificar, descartar o detectar la presencia de los virus anteriormente comentados, sanear si es el caso, y conservar in vitro las variedades de interés en las que se lleva a cabo una identificación utilizando marcadores SSR y un análisis de variabilidad genética cuando se dispone de varias accesiones. A modo de ejemplo, en este trabajo se publica el perfil de marcadores microsatélites para dos de las variedades colectadas y/o conservadas, la variedad 'Esclafacherre' ('Esclafagerres') y accesiones de 'Valencí Blanc' en las que se ha detectado diferencias para el marcador VVMD32 que agrupa las accesiones de Alicante por una parte, y al resto de accesiones por otra. También se ha validado un protocolo de crioconservación en la variedad 'Esclafacherre'. Por último, el Capítulo 5 hace referencia a un estudio llevado a cabo para determinar el estado actual de la aplicación de la transformación genética en vid, centrándonos en los factores limitantes de las metodologías empleadas. La transformación genética es una herramienta de gran potencial para la mejora de los cultivos, principalmente en plantas de p

Grapevine is a crop of vegetative propagation with great economical importance which is distributed worldwide in temperate zones. It is mainly used for wine and table grape production. Despite the fact thousands of varieties exist only few are commonly used, producing a loss of variability. Since the arrival of the phylloxera aphid the grapevine culture is performed using resistant rootstocks. The Directive Commission 2005/43/EC amending the Directive Council annexes 68/193/EEC, indicates that grapevine material should be free of these viruses: Grapevine fanleaf virus (GFLV), Grapevine leafroll associated virus 1 (GLRaV-1), Grapevine leafroll associated virus 3 (GLRaV-3), Grapevine fleck virus (GFkV) and Arabis mosaic virus (ArMV). In this work different methodologies related with in vitro culture were evaluated and developed with the aim of sanitate, mutiplicate and preserve grapevine germplam. In vitro preservation of grapevine varieties is a complementary stratregy of field preservation. In a preservation program it is important the selection of the starting material, determine its sanitary status, sanitate if it is necessary and, establish the appropriate in vitro conditions for its preservation. In the first chapter of this thesis (Chapter 1) the assays carried out for inducing somatic embryogenesis in 16 grapevine varieties which include six that were infected by the viruses GFLV, GLRaV-3 and GFkV are described. In grapevine, somatic embryogenesis has been described as a usefull methodology for virus sanitation and is the common pathway to adventitious regeneration. Efficient regeneration prototocols are necessary to address breeding by genetic transformation. In this work, cut seed are used as starting material and virus-free plants and high precentages of regeneration were obtained in all the varieties evaluated. The use of microsatellite markers has been useful to select those plants with the same genotype than the mother plant. From the other side, in this work, a micropropagation protocol starting from a healthy plant of the cultivar 'Monastrell' was developed and high multiplication rates with good adaptation to field conditions were obtained (Chapter 2). The culture medium MW was evaluated in 16 grapevine varieties as well as the following modifications: reduction in a half of the sugar content and elimination of the Indolebutyric Acid. The aim of these assays was to determine for each variety which conditions are the most appropiate to maintain in active in vitro culture this germplasm, lengthen the time between subcultures for reducing costs (Chapter 3). In Chapter 4 it is included a divulgation report that summarized the steps followed in the MINECO proyect CGL2015-70843-R for localizing and identifying grapevine varieties; discard or detect the presence of the viruses, sanitizing if it is necessary and, conserve in vitro the most interesting accessions. Microsatellite markers were used for genotyping. Analysis of variability were performed when several accessions were available. As an example, in this work it is published the microsatellite profile for two accessions of the endangered cultivar 'Esclafacherre' ('Esclafagerres') localized in two fields of the Valencian Community, and those of several accessions of 'Valencí Blanc' which differed for the VVMD32 marker, grouping the Alicante accessions and the rest of accessions from other origins. It was also validated a cryoconservation protocol for the 'Esclafacherre' variety. By last, Chapter 5 makes reference to a review performed with the goal to know the state of the art of genetic transformation in grapevine focusing on the main limiting factors of the employed methodologies. Genetic transformation is a potential tool for crop breeding, mainly in vegetative propagation plants.

La vinya és un cultiu de propagació vegetativa i de gran importància econòmica que es distribueix mundialment per zones temperades. La seua producció va destinada principalment a l'elaboració de vi, seguit de la producció de raïm de taula. Encara que existeixen milers de varietats, una desena d'elles son les que s'utilitzen majoritàriament a nivell mundial, el que comporta una pèrdua de variabilitat. Des de l'arribada de la fil·loxera, el cultiu de vinya es realitza mitjançant l'ampelt en peus resistents a aquest àfid. Segons la Comissió Directiva 2005/43/EC, el material de vinya ha d'estar lliure dels següents virus: GFLV, GLRaV-1, GLRaV-3, GFkV i ArMV. En este treball s'han avaluat i desenvolupat diferents metodologies relacionades amb el cultiu in vitro de plantes encaminades al sanejament, multiplicació i conservació de germoplasma de raïm. La conservació de varietats de raïm in vitro és molt important per a complementar la conservació de germoplasma en les col·leccions de camp. En el primer capítol d'esta tesi (Capítol 1) es descriuen els assaigs realitzats per a induïr l'embriogènesi somàtica en 16 varietats de raïm que inclouen sis varietats infectades amb els virus GFLV, GLRaV-3 i GFkV. En vinya, l'embriogènesi somàtica ha sigut descrita com una metodologia útil per al sanejament de plantes infectades amb virus i és la via comú de regeneració adventícia. En este treball s'utilitza com a material de partida llavors tallades i s'han obtingut plantes lliures de virus i percentatges de regeneració elevats en totes les varietats avaluades. La utilització de marcadors microsatèl·lits ens ha servit per a seleccionar entre les plantes regenerades aquelles que mostren el mateix genotip que les plantes de partida. Per altra banda, en este treball s'ha desenvolupat un protocol de micropropagació a partir de planta sana de la varietat 'Monastrell' cultivada in vitro, obtenint-se taxes de multiplicació elevades i plantes que s'han aclimatat a condicions de camp (Capítol 2). En el medi de cultiu MW, utilitzat per al desenvolupament de les plantes, s'han avaluat un total de 16 varietats i també s'ha comparat el creixement en este medi i en variacions d'este, com son la disminució de la concentració de sucre a la meitat i la eliminació de l'àcid indolbutíric. La finalitat d'estos assaigs ha sigut determinar per a cada varietat quines condicions són les més adequades per a mantindre el germoplasma vegetal en cultiu in vitro actiu però allargant el temps entre subcultius i optimitzant costos (Capítol 3). En el Capítol 4 s'inclou un treball de divulgació per a localitzar, identificar, descartar o detectar la presència dels virus anteriorment comentats, sanejar si cal, i conservar in vitro les varietats d'interés en les que es porta a cap una identificació utilitzant marcadors SSR i l'anàlisi de la variabilitat genètica quan es disposa de diverses accessions. A mode d'exemple, en estre treball es publica el perfil de marcadors microsatèl·lits per a dos de les accessions col·lectades de la varietat en perill d'extinció 'Esclafacherre' ('Esclafagerres'). També, es mostra el genotipat d'accessions de 'Valencí Blanc' en les que s'han detectat diferències per al marcador VVMD32 que agrupa les accessions d'Alacant per una banda, i a la resta d'accessions per altra. També s'ha validat un protocol de crioconservació en la varietat 'Escalfacherre'. Per últim, el Capítol 5 fa referència a un estudi portat a terme per a determinar l'estat actual de l'aplicació de la transformació genética en raïm, centrant-nos en els factors limitants de les metodologies empleades. La transformació genética és una ferramenta de gran potencial per a la millora dels cultius, principalment en plantes de propagació vegetativa.