Caracterización funcional de miRNAs específicos de melón relacionados con la repuesta a estrés

Abstract

The present work is based on previous results obtained from the analysis of sRNA populations determined by deep sequencing (Next Generation Sequencing) from melon plants (Cucumis melo L. cv. Piel de Sapo) exposed to different adverse conditions in order to carry out a systematic study of the response to stress, in which a predominant accumulation of sequences of 24 nucleotides was observed, followed by sequences of 21 nucleotides in length (the usual in most of the miRNAs described). To determine the possible biological activity of these sequences, as well as to identify and describe new melon miRNAs (different to the miRNAs deposited in the miRBase repository), a series of bioinformatic prediction methods supported by different biological assays were used. This work shows how both "species" of miRNAs can be isolated from samples of melon sRNAs by stem loop RT-PCR and verified by sequencing. A subsequent prediction of targets for said possible miRNAs followed by the study of them by 5'RLM-RACE allowed to determine that indeed some of the predicted targets were being degraded, isolating in certain occasions the canonical cut-off for the miRNA activity of the corresponding sRNA. Using a qRT-PCR the correlation between the previous studies of differential accumulation of the different sRNAs in the melon samples of the different stresses and the hypothetical response expected in the target mRNA levels of said sRNAs acting as miRNAs was confirmed. Of the predicted targets for the miRNAs analysed, the expected cuts and differential accumulations of the transcript were detectable in those targets that were possible for 21 nt miRNAs, while only two could be validated for sRNAs of 24 nt despite being the species predominant (more than 50% of the sRNAs analysed). Based on the results obtained in this work, 8 of the 26 analysed sRNAs present a sufficiently high level of evidence that would allow them to be annotated as true new melon stress responsive miRNAs. In the same way, these results seem to indicate that the miRNAs of 24 nt specific of melon could have evolved, by a specific adaptation mechanism, towards another type of regulation of gene expression alternative to the activity of cutting the transcript; such as inhibition of translation or methylation of regulatory sequences; although other biological tests would be necessary to determine it with precision.

El presente trabajo se basa en resultados previos obtenidos a partir del análisis de las poblaciones de sRNAs determinadas por secuenciación masiva (Next Generation Sequencing) provenientes de plantas de melón (Cucumis melo L. cv. Piel de Sapo) expuestas a diferentes condiciones adversas, con el fin de llevar a cabo un estudio sistemático de la respuesta a estrés, en el cual se observó una acumulación predominante de secuencias de 24 nucleótidos, seguida se secuencias de 21 nucleótidos de longitud (la habitual en la mayoría de los miRNAs descritos). Con el fin de determinar la posible actividad biológica de estas secuencias, así como identificar y describir nuevos miRNAs de melón (diferentes a los miRNAs depositados en el repositorio miRBase), se emplearon una serie métodos de predicción bioinformáticos respaldados por diferentes ensayos biológicos. En este trabajo se muestra cómo ambas ¿especies¿ de miRNAs pueden ser aisladas de muestras de sRNAs de melón por stem loop RT-PCR y verificadas por secuenciación. Una posterior predicción de dianas para dichos posibles miRNAs seguida del estudio de las mismas por 5¿RLM-RACE permitió determinar que efectivamente algunas de las dianas predichas estaban siendo degradadas, aislando en ciertas ocasiones el punto de corte canónico para la actividad como miRNA del correspondiente sRNA. Mediante una qRT-PCR se comprobó la correlación entre los estudios previos de acumulación diferencial de los diferentes sRNAs en las muestras de melón de los diferentes estreses, y la hipotética respuesta esperada en los niveles de mRNA diana de dichos sRNAs actuando como miRNAs. De las dianas predichas para los miRNAs analizados principalmente fueron detectables los cortes esperados y acumulaciones diferenciales del transcrito en aquellas dianas que lo eran para posibles miRNAs de 21 nt, mientras que solo dos pudieron ser validadas para sRNAs de 24 nt a pesar de ser la especie predominante (más del 50 % de los sRNAs analizados). En base a los resultados obtenidos en este trabajo 8 de los 26 sRNAs analizados presentan un nivel de evidencia lo suficientemente elevado que permitiría anotarlos como verdaderos miRNAs nuevos de melón de respuesta a estrés. Del mismo modo, estos resultados parecen indicar que los miRNAs de 24 nt específicos de melón podrían haber evolucionado, por un mecanismo de adaptación específico, hacia otro tipo de regulación de la expresión génica alternativa a la actividad de corte del transcrito; como la inhibición de la traducción o la metilación de secuencias reguladoras; aunque harían falta otros ensayos biológicos para determinarlo con precisión.