Análisis de la red de regulación de las proteínas DELLA mediante la generación de alelos edyéticos

Abstract

DELLA proteins are transcriptional regulators whose degradation is induced by gibberellins (GAs), plant hormones that participate in the modulation of numerous processes of development and defense against stress. DELLA proteins are not able to bind themselves to DNA and act through the interaction with dozens of transcription factors, modulating their activity, constituting central nodes for the integration of different signaling pathways. The implication of DELLA proteins in so many processes (i) makes it difficult to study each of their functions without affecting others and (ii) reduces the possibilities of their use as a biotechnological tool. It is for this reason that the identification of edgetics alleles, versions of DELLA proteins that have lost the ability to interact with one or more proteins while maintaining them with other interactors, is especially interesting. In this work, the identification of aristic alleles of the protein DELLA GAI of Arabidopsis thaliana is proposed for the first time. To this end, a mutagenized gene library of the GAI gene was generated by low fidelity PCR and two screenings were performed by double hybrid in yeast, against ARR1 and PIF4, to find GAI versions with potential to be edgetics alleles. Finally, the interaction capacity of these candidates has been evaluated with a battery of known GAI interactors using techniques such as the double hybrid assay in yeast, identifying 46 edgetics alleles, and as a proof of concept, the behavior has been verified in plant of one of them using BiFC (Bimolecular fluorescence complementation).

Las proteínas DELLA son reguladores transcripcionales cuya degradación es inducida por las giberelinas (GAs), hormonas vegetales que participan en la modulación de numerosos procesos de desarrollo y defensa frente al estrés. Las proteínas DELLA no son capaces de unirse por sí mismas al ADN y actúan a través de la interacción con decenas de factores de transcripción, modulando su actividad, constituyendo nodos centrales de integración de diferentes rutas de señalización. La implicación de las proteínas DELLA en tantos procesos (i) dificulta el estudio de cada una de sus funciones sin afectar otras y (ii) reduce las posibilidades de su utilización como herramienta biotecnológica. Es por este motivo que resulta especialmente interesante la identificación de alelos arísticos, versiones de las proteínas DELLA que han perdido la capacidad de interacción con una o más proteínas mientras que la mantienen con otros interactores. En este trabajo se plantea, por primera vez, la identificación de alelos arísticos de la proteína DELLA GAI de Arabidopsis thaliana. Para ello se ha generado una genoteca mutagenizada del gen GAI mediante PCR de baja fidelidad y se han realizado dos rastreos por doble híbrido en levadura, frente a ARR1 y PIF4, para encontrar versiones de GAI con potencial de ser alelos arísticos. Finalmente se ha evaluado la capacidad de interacción de dichos candidatos con una batería de interactores conocidos de GAI haciendo uso de técnicas como el ensayo de doble hibrido en levadura, identificando 46 alelos arísticos, y como prueba de concepto, se ha verificado en planta el comportamiento de uno de ellos mediante BiFC (Bimolecular fluorescence complementation).