Identificación y caracterización de mutantes afectados en el desarrollo foliar en líneas T-DNA de tomate

Abstract

Detection of mutants with some alteration in leaf development is the best strategy to identify the genes that control these characters. Among the possible alternatives to generate mutants (e.g., radiations, chemical products such as EMS, etc.), insertional mutagenesis is the most appropriate to address this objective. With this strategy, after obtaining a large number of transgenic plants, their phenotype is evaluated in order to detect alterations caused by the integration of T-DNA. If the disruption of an endogenous gene occurs, a loss-of-function mutant is usually obtained, whereas the insertion of the T-DNA in a control region or in the vicinity thereof can cause an alteration of its level of expression. In any case, since the endogenous gene is labeled by T-DNA, it is possible to reach cloning of the gene by means of PCR-based methods (eg Anchor- or Tail-PCR) and obtain valuable information on the role of that gene in the evaluated character. The development of an efficient genetic transformation protocol in tomato and related wild species (Solanum pimpinellifolium, S. pennellii and S. galapagense) has allowed obtaining more than 7,000 T-DNA lines in the context of several projects. We screened these collections of T-DNA lines to identify mutants altered in characters of vegetative and reproductive development, as well as in the level of tolerance to abiotic stresses, mainly salinity and drought. The frequency of mutants (dominant or recessive) for the evaluated characters is around 10% and Southern analysis reveals that the average number of inserts per line is moderate (1.7), which facilitates the identification of the T-DNA insert that generates the mutant phenotype. Within the framework of these projects, the identification of several genes has been achieved from mutants selected for different characters. In this work we propose the characterization of several altered mutants in leaf development through the screening of T-DNA lines.

La deteccción de mutantes con alguna alteración en el desarrollo foliar es la mejor estrategia para identificar los genes que controlan estos caracteres. Entre las alternativas posibles para generar mutantes (e.g. radiaciones, productos químicos como EMS, etc.), la mutagénesis insercional es la más adecuada para abordar este objetivo. Con esta estrategia, tras la obtención de un gran número de plantas transgénicas, se evalúa su fenotipo para poder detectar alteraciones causadas por la integración del T-DNA. Si se produce la disrupción de un gen endógeno se suele obtener un mutante de anulación de función, mientras que la inserción del T-DNA en una región de control o en la vecindad del mismo puede provocar una alteración de su nivel de expresión. En cualquier caso, como el gen endógeno queda etiquetado por el T-DNA, se puede llegar a la clonación del gen mediante métodos basados en la PCR (e.g. Anchor- o Tail-PCR) y obtener una valiosa información sobre el papel de ese gen en el carácter evaluado. El desarrollo de un protocolo eficaz de transformación genética en tomate y especies silvestres relacionadas (Solanum pimpinellifolium, S. pennellii, S. cheesmaniae) ha permitido la obtención de más de 7.000 líneas T-DNA en el contexto de varios proyectos. Se ha realizado el escrutinio de estas colecciones de líneas T-DNA para identificar mutantes alterados en caracteres del desarrollo vegetativo y reproductivo, así como en el nivel de tolerancia a estreses abióticos, principalmente salinidad y sequía. La frecuencia de mutantes (dominantes o recesivos) para los caracteres evaluados está en torno al 10 % y los análisis Southern revelan que el número medio de insertos por línea es moderado (1.7), lo que facilita la identificación del inserto de T-DNA que genera el fenotipo mutante. En el marco de estos proyectos, se ha conseguido la identificación de varios genes a partir de mutantes seleccionados para diversos caracteres. En el presente TFM lo que planteamos es la identificación y caracterización de mutantes alterados en el desarrollo foliar mediante el escrutinio de líneas T-DNA.