Caracterización de factores celulares involucrados en el transporte viral y en la interacción de la proteína de movimiento del virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus) con la proteína codificada el gen de resistencia Sw-5b

Abstract

El ciclo infectivo viral en una planta huésped susceptible de infección, se inicia en la mayoría de los casos, con la entrada del virus en las células de la epidermis o del mesófilo, a través de las heridas producidas mediante inoculación mecánica o con la ayuda de vectores biológicos (insectos, nemátodos, hongos, etc.). Una vez completado los primeros ciclos de replicación los virus deben ser capaces de traslocarse intracelularmente hasta alcanzar los canales citoplasmáticos que conectan dos células contiguas, denominados plasmodesmos (PDs), los cuales, en circustancias normales solo permiten el paso de pequeñas moléculas e iones entre células (Carrington et al., 1996; Lucas and Lee,2004). En este tránsito intracelular los virus aprovechan determinados factores implicados en la maquinaria de movimiento de los componentes celulares. Para ello sintetizan las denominadas proteínas de movimiento viral (MPs) que están directamente implicadas tanto en el movimiento intra- como intercelular. En nuestro laboratorio, tradicionalmente se ha estudiado la superfamilia 30K de MPs, o grupo de 17 géneros diferentes cuya MP está relacionada con la MP de 30kD del Virus del mosaico de tabaco (Melcher, 2000). Las evidencias que respaldan el concepto de familia 30K de MPs se basan en experimentos de complementación utilizando plantas transgénicas que expresan los RNAs 1 y 2 del virus del mosaico de la alfalfa (AMV). En trabajos previos se ha comprobado que la MP del AMV es funcionalmente intercambiable por diferentes MPs asignadas dentro de la superfamilia 30K (Fajardo et al., 2013; Sánchez-Navarro and Bol, 2001; Sánchez-Navarro et al., 2006). La identificación de factores celulares que interaccionan con las MPs asignadas a la superfamilia 30K es escasa, reflejando, probablemente, la dificultad para trabajar con estas peculiares proteínas que están íntimamente asociadas al sistema de endomembranas (Martínez-Gil et al., 2009; Peiró et al., 2014b) o que llegan a ser fácilmente no funcionales por pequeñas modificaciones. Por otro lado, en algunos patosistemas se ha visto que la MP interacciona con los productos de genes de resistencia (R) (Weber et al., 2004) actuando como factor de avirulencia (Avr) y superando la resistencia conferida por estos genes (Peiró et al., 2014a). La reciente observación en nuestro laboratorio de que las MPs intercambiadas en el sistema de AMV podrían ser modificadas con secuencias tag (HA o Twin Strep tag, TST) sin afectar a la funcionalidad de la proteína permite interesantes enfoques para caracterizar factores celulares que interaccionen con las MPs de la familia 30K mediante experimentos de inmunoprecipitación y la identificación de los componentes desconocidos mediante espectrometría de masas. Recientemente, hemos determinado que la MP del Virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV) es el Avr del gen de resistencia Sw-5b (Peiró et al., 2014a). Sin embargo y como en la mayoría de las resistencias mediadas por genes R, se desconoce cómo se realiza el proceso de reconocimiento del Avr así como los factores celulares implicados. En el presente proyecto abordaremos la caracterización de los factores celulares implicados en el reconocimiento de la MP de TSWV por parte del gene Sw-5b. Para ello utilizaremos diferentes MPs de TSWV que superan o no la resistencia mediada por el gen Sw-5b. En concreto, disponemos de una MP de TSWV que no supera la resistencia mediada por el gen SW-5 (Gr1NL2), una variante que la supera y que difiere en dos residuos de amino ácido (GRAU) y los dos mutantes con cada uno de los residuos mutado (GRAU-T120 y GRAU-V130). Las cuatro MPs se introducirán en el sistema del RNA 3 de AMV con la etiqueta TST. Tras comprobar que todas las construcciones quimera son funcionales procederemos a caracterizar los factores celulares que interaccionan con la MPs de TSWV mediante experimentos de inmunoprecipitación utilizando tanto tejido infe