Análisis de la expresión de moléculas de adhesión en cultivos celulares primarios derivados de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas

Abstract

[ES] El cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa el 85% de los casos de cáncer de pulmón, enfermedad que supone la segunda causa de muerte a nivel nacional. Esta elevada mortalidad está relacionada entre otros factores con la aparición de resistencias a los tratamientos, a su vez asociada con la existencia de una subpoblación de células llamadas células madre tumorales. De ahí, el interés por establecer marcadores específicos que permitan la caracterización de estas células y de esta forma poder diseñar estrategias terapéuticas dirigidas específicamente contra ellas. Para ello, se han desarrollado métodos de cultivo de estas células madre tumorales basándose en su capacidad para formar esferas en condiciones no adherentes y medio libre de suero. Sin embargo, se ha observado que el fenotipo que las tumoresferas adquieren en los cultivos 3D es variable y se piensa que puede estar correlacionado con la expresión de genes implicados en la adhesión celular. Este trabajo se realizó en 7 muestras tumorales de pacientes resecados con CPNM y en 12 líneas celulares crecidas en monocapa y en placas de baja adherencia con medio sin suero (tumoresferas). La expresión de genes relacionados con la adhesión celular (CLDN1, CLDN3, CLDN4, CLDN6, CLDN7, CLDN8, CLDN14, Vcam1, OCLN, JAM1, GJA1, GJB6, EPCAM, CDH1, VIM, ITGA2, ITGA6, ITGB1 y CTNNB1) se analizó mediante PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR), normalizándose frente a la expresión de tres genes controles seleccionados: ACTB, CDKN1B y GUSB, utilizados para el cálculo de la expresión relativa y un ADNc de referencia comercial. Las tumoresferas de pulmón presentaron una expresión incrementada de CLDN4, CDH1 y ITGA6 (p= 0,05, p= 0,049 y p= 0,002, respectivamente) comparadas con sus correspondientes células crecidas en adherencia. Asimismo, el estudio de las posibles correlaciones entre los genes mostró un patrón de coexpresión entre la mayoría de ellos ya que están implicados en el mismo proceso de adhesión celular, siendo estas correlaciones estadísticamente significativas entre CLDN3-CLDN4 (p=0,001), CDH1-CTNNB1 (p=0,008) o VIM-EPCAM (p=0,012). Por otra parte, el análisis de la expresión génica relativa demostró también que la sobreexpresión de E-cadherina y Conexina 43 se relaciona con la formación de tumoresferas compactas, mientras que la expresión aumentada de la integrina b6 se asocia con la obtención de agregados laxos de CSCs. Con todo ello, se propone la modulación de la expresión de los genes involucrados en la adhesión celular que condicionan la morfología de los esferoides de CSCs como una opción terapéutica para tratar a los pacientes con CPNM.

[EN] Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) represents approximately 85% of lung cancer cases, a disease which accounts for the second cause of death in Spain. This high mortality is related with the existence of resistances to treatments, which is associated with the presence of a subpopulation of cells called Cancer Stem Cells (CSC). For this reason, interest is set in establishing specific markers which allow the characterization of these cells in order to design therapeutic strategies targeted specifically to these cells. As a result, different culture methods have been proposed based on the ability of CSCs to form spheres in non-adherent conditions and in serum-free medium. However, the phenotype of the tumorspheres in 3D cell cultures is variable and it is believed that it is linked to the expression of genes implicated in cell adhesion. This study was carried with 7 samples from resectable NSCLC patients and 12 cell lines grown both in monolayer and as spheroids. The expression of genes related with cell adhesion (CLDN1, CLDN3, CLDN4, CLDN6, CLDN7, CLDN8, CLDN14, Vcam1, OCLN, JAM1, GJA1, GJB6, EPCAM, CDH1, VIM, ITGA2, ITGA6, ITGB1 y CTNNB1) was analysed by quantitative real-time PCR. Housekeeping genes ACTB, CDKN1B and GUSB were used as endogenous controls for relative expression calculation. Lung tumorspheres had increased expression of CLDN4, CDH1 y ITGA6 (p= 0,05, p= 0,049 y p= 0,002, respectively) when compared to their paired-adherent cells. Moreover, when studying possible correlations between genes, a coexpression pattern was observed between most of them since they are involved in the same process of cell adhesion, being significant the correlations between CLDN3-CLDN4 (p=0.001), CDH1-CTNNB1 (p=0.008) or VIM-EPCAM (p=0.012). What’s more, the relative gene expression analysis revealed that the overexpression of E-cadherin and Connexin 43 was related with the formation of tight tumorspheres while the increased expression of integrin b6 was associated with the presence of loose aggregates of CSCs. Altogether, the modulation of the expression of these genes involved in cell adhesion, which determine the spheroids morphology, is proposed as a therapeutic option to treat NSCLC patients.