Ensayo de supervivencia espermática como método para evaluar la toxicidad de los crioprotectores usados en los programas de criopreservación espermática en Reproducción Asistida: Diseño de dos índices de toxicidad basados en parámetros cinéticos del espermatozoide humano

Abstract

El proceso de congelación de espermatozoides tiene un gran impacto sobre la calidad de la muestra, destacando fundamentalmente daños mecánicos y osmóticos que van a llevar a un descenso de la viabilidad espermática. La vitalidad espermática se refleja en la proporción de espermatozoides que están vivos, atendiendo a su capacidad osmorreguladora o de exclusión de colorantes. Asimismo, a pesar de que hay diferentes estudios centrados en determinar el protocolo de congelación/descongelación óptimo, son muy pocos los esfuerzos que se han dedicado a realizar estudios independientes de toxicidad espermática para elegir el crioprotector que minimice los efectos citotóxicos que tienen estos agentes sobre el espermatozoide.

En este trabajo se realizaron dos experimentos sucesivos. En primer lugar se analizó la posible correlación de dos ensayos de viabilidad distintos (test de la eosina y HOS- test) con la motilidad de las muestras, considerando que aquellos espermatozoides viables serán los que presenten algún tipo de motilidad, con el fin de obtener una nueva variable más objetiva que permita estimar de forma fiable los resultados obtenidos en términos de viabilidad espermática.

Los resultados mostraron que la motilidad total (MT) era el tipo de motilidad que mejor se correlacionaba con los resultados del HOS-test (R2=97.10, CMR=1,36x10^-5), mientras que los resultados obtenidos mediante el test de la eosina no presentan correlación alguna con ningún tipo de motilidad. De acuerdo con los resultados obtenidos, la MT fue la variable de elección que se empleó en la segunda parte del estudio puesto que es una medida más objetiva, sencilla y rápida.

Por tanto, la MT aportará mayor solidez al estudio de la evaluación de toxicidad de los distintos crioprotectores que los test de vitalidad clásicos.

A continuación, se evaluó la toxicidad, en base a la MT, de dos crioprotectores distintos, uno a base de yema de huevo (TYB) y otro sin excipientes de origen animal (SCB), a distintas concentraciones con el fin de optimizar los protocolos de congelación de espermatozoides humanos en las unidades de reproducción humana asistida. Los ensayos de supervivencia espermática hasta las 24 horas revelaron que a tiempos cortos de incubación no se observaron diferencias significativas entre la pérdida de MT entre las muestras control y las muestras incubadas con los distintos crioprotectores (p-val= 0,2621). Sin embargo, a partir de la primera hora, las muestras incubadas con el crioprotector SCB mostraron una mayor pérdida de MT (p-val=0,013). Tras dos horas de incubación, se observó un cambio de tendencia, ya que las muestras incubadas con SCB parecían preservar mejor la MT, mientras que se evidenció una mayor caída de MT en las muestras control y las incubadas con TYB (p-val=0,0247). Por tanto se recomienda que entre la adición del crioprotector y el inicio de la congelación no transcurra más de una hora, ya que a tiempos cortos no se observan diferencias entre el medio control y los medios crioprotectores, en términos de MT.

The process of sperm freezing has a great impact among the quality of the sample, promoting mainly mechanical and osmotic damage that can lead to a decrease on the spem vitality of the sample. The sperm vitality is reflected in the proportion of sperm that are alive, according to their osmoregulatory capacity or their ability of exclude dyes from its membrane.

Although there are different studies focused on determining the optimal freezing / thawing protocol, very few efforts have been devoted to perform independent studies of sperm toxicity in order to choose the cryoprotectant that minimizes the most the cytotoxic effects that these agents have on the spermatozoa.

In this work, two successive experiments were carried out. In the first place, the possible correlation of two different viability tests (eosin test and HOS-test) with the motility of the samples was analyzed, considering that the viable sperm will be those that present some type of motility. This analisys was developed in order to obtain a new more objective variable that allows to reliably estimate the results obtained in terms of sperm viability.

The results showed that the total motility (TM) was the type of motility that best correlated with the results of the HOS-test (R2 = 97.10, RMS = 1.36 x 10^-5), while the results obtained by the eosin test presented no correlation with any type of motility. According to the results obtained, the TM was the chosen variable that would be used in the second part of the study since it is a more objective, simple and quicker. Therefore, the robustness of the study of the toxicity of differents cryoprotectants is increased by using a toxicity index based on sperm total motility rather than by the use of classical viability tests. Then, the toxicity of two different cryoprotectants, one based on egg yolk (TYB) and another without animal extents (SCB), was studied by using the TM. Different concentrations were analysed in order to optimize the protocols of human sperm freezing in Assisted Reproduction.

Sperm survival tests up to 24 hours revealed that at short incubation times there were no significant differences between the decrease in TM showed in the control samples and the ones that were incubated with the different cryoprotectants (p-val = 0.2621). However, from the first hour, the samples incubated with the cryoprotectant SCB showed a greater loss of TM (p-val = 0.013). After two hours of incubation, a change in trend was observed, since the samples incubated with SCB seemed to have a better preservation of the TM, while a greater TM decrease was observed in the control samples and those incubated with TYB (p-val = 0 , 0247).

Therefore, it will be recommended that the time between the addition of the cryoprotectant and the onset of freezing process will not be longer than one hour, since at short times no differences are observed between the control medium and the cryoprotective means, in terms of sperm motility.