Análisis de la interacción entre el canal de potasio de Arabidopsis KAT1 y las proteínas de la familia BAG

Abstract

[EN] Potassium is a monovalent cation essential for survival of all organisms, as it is involved in many biological processes. In plants, it plays an important role in regulating the opening and closure of the stomata. As these processes are controlled by cell turgor, generated in part by potassium fluxes through the membranes of the guard cells, plants possess high-affinity potassium channels that enable these large potassium fluxes. As stomata are involved in transpiration and gas exchange, the regulation of these potassium channels is essential for plants to resist salinity and drought stresses. In this study, we have focused in the interaction between KAT1, an inward rectifying potassium channel, and the AtBAG family proteins, both from Arabidopsis thaliana.

KAT1 is an inward rectifying voltage gated potassium channel belonging to the Shaker family and is the dominant K+ influx channel in guard cells. As it plays an important role in the stomatal opening and closure, its regulation is likely to be essential for drought resistance. The AtBAG family is composed by seven A. thaliana proteins that share a common BAG domain which, by homology to their mammalian counterparts have been implicated in programmed cell death and stress responses.

In previous studies, our group identified, by means of Split-Ubiquitin Yeast Two Hybrid assays, 14 different proteins that interacted with KAT1. One of these proteins was AtBAG4, a member of the AtBAG family. Thus, in this study we aimed to determine the specificity of the interaction between KAT1 and AtBAG4. With this aim we performed a Split-Ubiquitin assay, using KAT1 as bait and three different AtBAG proteins as prey. In addition, we aimed to map the KAT1-AtBAG4 interaction using a conventional Yeast Two Hybrid assay, using the C-terminal region of KAT1 as bait and AtBAG4 as prey. However, the limitations of this assay impeded the proper mapping of the interaction. Finally, the effects of the KAT1-AtBAG interactions were determined by performing a functional complementation assay using a yeast strain lacking its endogenous potassium transporter genes. The results showed that the interaction between KAT1 and the AtBAG proteins increased the capacity of KAT1 to generate potassium influxes.

[ES] El potasio es un catión monovalente esencial para la supervivencia de todos los organismos, ya que está involucrado en gran cantidad de procesos biológicos. En plantas, juega un importante papel en la regulación de la apertura y cierre de las estomas. Dado que estos procesos están controlados por la turgencia de las células guarda, principalmente generada por los flujos de potasio a través de sus membranas, las plantas poseen canales de potasio de alta afinidad, que permiten estos grandes flujos de potasio. Dado que las estomas están involucradas en la transpiración y el intercambio gaseoso de las plantas, la regulación de estos canales de potasio es esencial para la resistencia de las plantas a la sequía y el estrés salino. En este estudio nos centramos en la interacción entre KAT1, un canal rectificador de potasio, y las proteínas de la familia AtBAG, ambos provenientes de Arabidopsis thaliana.

KAT1 es un canal rectificador de corriente de potasio que pertenece a la familia Shaker y es el canal interno de K+ dominante en las células guarda. Dado que juega un papel muy importante en la apertura y cierre de las estomas, su regulación puede ser esencial para la resistencia a la sequía. La familia de proteínas AtBAG está compuesta por siete proteínas de A. thaliana que comparten un dominio BAG común, y se han en la respuesta a estreses y la muerte celular programada.

En estudios previos nuestro grupo identificó 14 proteínas que interaccionaban con KAT1, mediante ensayos de Split-Ubiquitin Yeast Two Hybrid. Una de estas fue AtBAG4, un miembro de la familia AtBAG. Por ello, en este estudio decidimos determinar la especificidad de la interacción entre KAT1 y AtBAG4. Para ello, se realizaron ensayos de Split-Ubiquitin Yeast Two Hybrid, usando como KAT1 como cebo y 3 proteínas de la familia AtBAG como presa. Además, intentamos mapear la interacción con KAT1 mediante un ensayo de doble híbrido de levadura convencional, empleando la región C-terminal de KAT1 como cebo y AtBAG4 como presa. No obstante, las limitaciones de esta técnica impidieron realizar correctamente el mapeo. Finalmente, los efectos de la interacción se determinaron mediante un ensayo de complementación funcional, empleando una cepa de levadura carente de transportadores endógenos de potasio. Los resultados mostraron que la interacción entre KAT1 y las proteínas de la familia AtBAG aumentaba la capacidad de KAT1 de generar influjos de potasio.