Modulación de la adaptación a estrés por el metabolismo respiratorio y el envejecimiento

Abstract

[ES] Las células eucariotas se adaptan continuamente a estreses abióticos como por ejemplo el estrés osmótico o el estrés oxidativo. Ambos estreses están fisiológicamente relacionados, y en estudios anteriores se ha podido establecer que una eficiente adaptación al estrés hiperosmótico y salino requiere una activación del metabolismo respiratorio a través de la inducción de la función mitocondrial y peroxisomal. En el presente trabajo se estudiará cómo influye la función de los dos orgánulos y el proceso del envejecimiento en la dinámica adaptación a estrés. Para ello, se plantean tres abordajes experimentales usando la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo celular. 1- Se determinará cómo influye la función mitocondrial y peroxisomal en la respuesta dosis dependiente de la expresión génica a estrés osmótico. Se emplearán cepas transformadas con reporteros de luciferasa desestabilizada específicos para dicho estrés. Se cuantificará en tiempo real la capacidad de dosis respuesta de cada cepa y se comparará de forma cuantitativa la sensibilidad y posibles defectos de señalización entre las cepas sin y con mutaciones mitocondriales o peroxisomales. 2- Peroxisomas y mitocondrias están conectados físicamente por proteínas de la membrana exterior de los dos orgánulos, como Pex11 y Mdm34 en levadura. Previos estudios han mostrado que el número de peroxisomas asociados a la red mitocondrial aumenta en situaciones de estrés salino. En el presente trabajo se cuantificará el grado de asociación entre los dos orgánulos por microscopía de fluorescencia. Se usarán cepas modificadas con fusiones de Pex11 y Mdm34 con los dominios N- y C-terminales de YFP en ensayos de BiFC in vivo (complementación bimolecular de fluorescencia). Se cuantificará así la interacción de mitocondrias y peroxisomas durante la inducción de la respiración y la adaptación a estrés. 3- Se estudiará cómo influye el envejecimiento de las células en su capacidad de activar la expresión génica en respuesta a estrés oxidativo. Una característica clave de las células envejecidas es la acumulación de daños oxidativos intracelulares y una menor capacidad de detoxificar ROS. Se estudiará en dos modelos diferentes del envejecimiento de levadura, el replicativo y el cronológico, cómo cambia la capacidad de defensa ante el estrés oxidativo durante el proceso del envejecimiento. Se emplearán cepas con reporteros luciferasa integrativos y específicos para el estrés oxidativo en estudios de la expresión génica en tiempo real y a lo largo de los diferentes regímenes de envejecimiento.

[EN] Eukaryotic cells continuously adapt to abiotic stresses such as osmotic or oxidative stress. Both stresses are physiologically related, and in previous studies it has been established that an efficient adaptation to hyperosmotic and saline stress requires an activation of respiratory metabolism through the induction of mitochondrial and peroxisomal function. In the present work we study how the function of the two organelles and the aging process influences the dynamic adaptation to stress. Three experimental approaches are proposed using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a cellular model. 1- It will be determined how mitochondrial and peroxisomal function influences the dosedependent response of gene expression to osmotic stress. Strains transformed with destabilized luciferase reporters will be used. The dose response capacity of each strain will be quantified in real time and the sensitivity and possible signaling defects between the strains without and with mitochondrial or peroxisomal mutations will be quantitatively compared. 2- Peroxisomes and mitochondria are physically connected by proteins of the outer membrane of the two organelles, for example Pex11 and Mdm34 in yeast. Previous studies have shown that the number of peroxisomes associated with the mitochondrial network increases in situations of salt stress. In the present work, the degree of association between the two organelles will be quantified by fluorescence microscopy. Strains modified with Pex11 and Mdm34 fusions with the N- and C-terminal domains of YFP will be used in BiFC assays in vivo (bimolecular fluorescence complementation). The interaction of mitochondria and peroxisomes during the induction of respiration and adaptation to stress will be quantified. 3- It will be studied how the aging of cells influences their ability to activate gene expression in response to oxidative stress. A key feature of aging cells is the accumulation of intracellular oxidative damage and a decreased ability to detoxify ROS. We will study in two different models of yeast aging, the replicative and the chronological, how the defense capacity changes in response to oxidative stress during the aging process. Strains with integrative and specific luciferase reporters for oxidative stress will be used in studies of gene expression in real time and throughout the different aging regimes.