Desarrollo de circuitos genéticos de regulación postraduccional basados en la proteasa NIa de los potyvirus

Abstract

[ES] Los futuros desarrollos en biología sintética de plantas requerirán que previamente se haya definido una serie de elementos genéticos capaces de desarrollar funciones precisas y específicas en las células donde se expresan. Recientemente, el grupo de investigación Biotecnología de Virus de Plantas (IBMCP, CSIC-Universitat Politècnica de València) ha desarrollado circuitos genéticos capaces de realizar operaciones lógicas básicas (YES, OR y AND) en plantas, cuya señal de salida es la acumulación de pigmentos endógenos visibles a simple vista y cuantificables espectrofotométricamente. Estos circuitos se basan en la actividad del factor de transcripción Rosea1 de Antirrhinum majus que induce la producción de antocianinas. Cuando este factor de transcripción se fusiona a un fragmento amino terminal de la RNA polimerasa NIb del virus del mosaico de la sandía es inactivo. Sin embargo, cuando entre estos dos elementos se interpone la diana de reconocimiento de la proteasa NIa (NIaPro) de un potyvirus y se coexpresa esta proteasa altamente específica en el tejido de la planta, su actividad libera al factor de transcripción con la consiguiente acumulación de antocianinas. En este trabajo, utilizando el circuito sintético YES de acumulación de antocianinas desencadenado por la expresión de NIaPro, se ha analizado la eficiencia de las proteasas de una serie de especies distintas de potyvirus pertenecientes a distintos clados en su árbol filogenético. Con ello se ha pretendido aumentar el número de proteasas específicas disponibles para futuros desarrollos de biología sintética. Para ello se clonaron los cDNAs de las NIaPro de diez potyvirus y, mediante expresión transitoria en Nicotiana benthamiana mediada por Agrobacterium tumefaciens, se enfrentaron a sus dianas peptídicas incluidas en diferentes versiones de la puerta YES. La eficiencia del procesamiento de cada proteasa se determinó cuantificando la acumulación de antocianinas en el tejido infiltrado de N. benthamiana. Los resultados mostraron que las NIaPro del virus del grabado del tabaco, virus del mosaico del nabo y virus de la viruela del ciruelo son muy eficientes en el reconocimiento de su diana específica. Por contra, las NIaPro del virus del moteado de las venas del tabaco (TVMV), virus del mosaico de la soja y virus del enanismo amarillo de la cebolla son poco eficientes e incapaces de activar una acumulación substancial de antocianinas. Sin embargo, como se demuestra en el caso del TVMV, esta baja eficiencia se puede contrarrestar multiplicando el número de dianas en la construcción reportera YES. En el caso de las dianas del virus del mosaico del Hordeum (HoMV), virus del moteado de las venas del pimiento, virus del mosaico de la lechuga y virus Y de la patata se observó que el fragmento de NIb no era capaz de inhibir la actividad de Rosea1. No obstante, este problema también puede ser solucionado aumentando el tamaño del fragmento inhibitorio de 100 a 200 aminoácidos, como se muestra en el caso del HoMV. En conclusión, esta investigación ha permitido aumentar el número de proteasas específicas disponible para desarrollos de biología sintética en plantas y ha marcado algunas líneas de actuación para incorporar otras menos eficientes.

[EN] Future research in plant synthetic biology will require definitions of new elements able to develop precise and specific functions in cells. Recently, the research group Plant Viruses Biotechnology (IBMCP, CSIC-Universitat Politècnica de València) has developed different genetic circuits capable of performing basic logic operations (YES, OR and AND) in plants. The output signal of these circuits is the accumulation of plant endogenous pigments, which are visible to the naked eye and are also spectrophotometrically quantifiable. These circuits are based on the activity of the Antirrhinum majus transcription factor Rosea1 that induces anthocyanins production. When this transcription factor is fused with an amino terminal fragment of the watermelon mosaic virus RNA polymerase (NIb) is inactive. However, when between these elements the potyvirus NIa protease (NIaPro) recognition site is interposed, and this highly specific protease is coexpressed in the plant tissue, the proteolytic activity produces the release of the transcription factor, which triggers the anthocyanin accumulation. In this work, using the YES anthocyanin accumulation synthetic circuit triggered by the expression of NIaPro, we have analized the efficiency of potyvirus proteases that belong to different clades of the potiviral phylogenetic tree. With this, we want to increase the number of specific proteases available for future developments in synthetic biology. To this end, we have cloned the NIaPro cDNAs of ten potyviruses and, by transient expression in Nicotiana benthamiana mediated by Agrobacterium tumefaciens, they faced their peptide targets included in different versions of the YES gate. The processing efficiency of each protease was determined by quantifying anthocyanin accumulation in the infiltrated tissue of N. benthamiana. The results showed that the NIaPro of tobacco etch virus, turnip mosaic virus, and plum pox virus are very efficient in the recognition of their specific target. On the other hand, the NIaPro of tobacco vein mottling virus (TVMV), soybean mosaic virus and onion yellow dwarf virus are not as efficient as the above mentioned and unable of activating a substantial accumulation of anthocyanins. However, as shown in the case of TVMV, this low efficiency can be counteracted by multiplying the number of recognition sites in the YES reporter construction. In the case of Hordeum mosaic virus (HoMV) recognition sites, pepper veinal mottle virus, lettuce mosaic virus and potato virus Y, it was observed that the NIb fragment was not able to inhibit the activity of Rosea1. However, this problem can also be addressed by increasing the size of the inhibitory fragment from 100 to 200 aminoacids, as shown in the case of HoMV. In conclusion, this research has allowed to increase the number of specific proteases available for synthetic biology developments in plants and has marked some lines of action to incorporate other less efficient ones.