Papel de laforina y malina en la modulación de β-arrestinas y su implicación en el reciclaje del transportador de glutamato EAAT2/GLT1 en la enfermedad de Lafora

Abstract

[ES] La enfermedad de Lafora (LD, OMIM 254780) es una epilepsia mioclónica progresiva rara de herencia autosómica recesiva, provocada por mutaciones con pérdida de función de los genes EPM2A y EPM2B. Estos genes codifican, respectivamente, para las proteínas laforina, una fosfatasa dual capaz de defosforilar carbohidratos y malina, una E3 ubicuitín ligasa mediadora en procesos de degradación. Se ha descubierto que laforina y malina forman un complejo funcional, hecho que explica que mutaciones en cualquiera de las dos proteínas resulten en un mismo fenotipo. La enfermedad se caracteriza por la acumulación de poliglucosanos insolubles, denominados cuerpos de Lafora, en el citoplasma de células del sistema nervioso, corazón, músculo esquelético e hígado, una rápida neurodegeneración y epilepsia con convulsiones mioclónicas. En relación con las bases moleculares responsables de la epilepsia, se ha descubierto que en modelos murinos de la enfermedad de Lafora existe una acumulación de glutamato en el espacio sináptico, hecho que provoca una alta excitotoxicidad, por la sobreactivación de diferentes enzimas, e incluso la muerte neuronal. Esta acumulación es fruto de una disminución de los niveles del transportador EAAT2/GLT-1 en la membrana plasmática de astrocitos. Diversos estudios apuntan a la proteína Nedd4.2, una E3 ubicuitín ligasa, como la mediadora en las vías de degradación y reciclaje del transportador, necesitando para ello la ayuda de proteínas adaptadoras como las β-arrestinas. Con el fin de caracterizar la causa por la cual se produce el defecto de EAAT2/GLT-1 en la membrana de astrocitos en modelos murinos de la enfermedad de Lafora, así como el papel de laforina y malina en el reciclaje del transportador, se han estudiado las posibles interacciones de las β-arrestinas (β-arrestina 1 y β-arrestina 2) con laforina y malina mediante las técnicas de doble híbrido en levadura, e inmunoafinidad con GFP en células de mamífero. Para poder llevar a cabo los ensayos de doble híbrido en levadura se realizaron las construcciones necesarias para la expresión de la β-arrestina 1 y β-arrestina 2 como proteínas de fusión al dominio de activación de la transcripción GAL4. Los resultados de este trabajo indican que no existe interacción de β-arrestina 1 y β- arrestina 2 con laforina y malina mediante la técnica de doble híbrido de levadura. Sin embargo, mediante la técnica de inmunoafinidad con GFP en la línea celular HEK293 se puede observar interacción de β-arrestina 1 con laforina y malina, tanto de forma independiente como formando parte del complejo, e interacción de β-arrestina 2 con laforina en ausencia de malina.

[EN] Lafora disease (LD, OMIM 254780) is a rare progressive myoclonic epilepsy of autosomal recessive inheritance, caused by loss of function mutations in the EPM2A and EPM2B genes. These genes encode, respectively, the proteins laforin, a dual phosphatase capable of dephosphorylating carbohydrates, and malin, an E3 ubiquitin ligase involved in degradation processes. It has been discovered that laforin and malin form a functional complex, this fact explaining that mutations in either of the two proteins result in the same phenotype. The disease is characterized by the accumulation of insoluble polyglucosans, called Lafora bodies, in the cytoplasm of nervous system’s cells, heart, skeletal muscle and liver, and by a rapid neurodegeneration and epilepsy with myoclonic seizures. In relation to the molecular bases responsible for epilepsy, it has been discovered that, in murine models of Lafora disease there is an accumulation of glutamate in the synaptic space, which causes a high excitotoxicity, by overactivation of different enzymes, and even neuronal death. This accumulation is the result of a decrease in the levels of the EAAT2 / GLT-1 transporter in the plasma membrane of primary astrocytes. Several studies point to the protein Nedd4.2, an E3 ubiquitin ligase, as the mediator in the pathways of degradation and recycling of the transporter, requiring for this the help of adapter proteins such as β-arrestins. In order to characterize the cause of the defect in EAAT2 / GLT-1 in the membrane of astrocytes from Lafora murine models, as well as the role of laforin and malin in the recycling of the transporter, we have studied the possible interactions of the β-arrestins (β-arrestin 1 and β-arrestin 2) with laforin and malin by yeast two hybrid and GFP-trap in mammalian cells. To carry out the yeast two hybrid assays, the constructs needed for the expression of β-arrestin 1 and β-arrestin 2 as fusion proteins to the transcription activation domain GAL4 were made. The results of this work indicate that there is no interaction of β-arrestin 1 and β-arrestin 2 with laforin and malin using the yeast two hybrid technique. However, the GFP-trap in HEK293 cell line shows interaction of β-arrestin 1 with laforin and malin, both independently and as part of the complex, and interaction β -arrestin 2 with laforin in the absence of malin.