Estudio del mecanismo de acción de proteínas antifúngicas en Penicillium digitatum mediante análisis transcriptómico

Abstract

[ES] Las infecciones causadas por hongos representan un importante riesgo para la salud humana, la producción de alimentos y la seguridad alimentaria. Sin embargo, se han introducido muy pocos compuestos antifúngicos en el mercado de fungicidas en los últimos años. Por ello, es necesario encontrar nuevas moléculas antifúngicas y a ser posible con modos de acción diferentes a los de los antifúngicos ya usados. Algunos hongos filamentosos producen y secretan grandes cantidades de proteínas AFPs (AntiFungal Proteins) con actividad antifúngica. Estas AFPs son pequeñas, catiónicas y ricas en cisteínas que forman puentes disulfuro, y tienen un gran interés biotecnológico por su elevada actividad antifúngica, especificidad y estabilidad. Sin embargo, su mecanismo de acción antifúngico y su función biológica en el hongo productor apenas se conocen. Con el objetivo de caracterizar el modo de acción de la proteína antifúngica AfpB sobre el patógeno de frutos cítricos Penicillium digitatum del cual procede, se ha realizado un análisis transcriptómico basado en la secuenciación masiva o RNA-seq. Para ello, se han realizado distintos tratamientos de AfpB sobre la cepa de referencia P. digitatum CECT 20794 (ausencia de AfpB, tratamiento durante 1 ó 3 horas, y crecimiento en presencia de AfpB) y se ha incluido en el análisis la cepa modificada genéticamente PDSG420 que es sobreproductora de la proteína antifúngica. Se observaron los efectos de la proteína sobre el crecimiento del hongo en cada caso. Se determinaron los cambios en el transcriptoma, obteniéndose un elevado número de genes expresados de forma diferencial (DEG, Differentially Expressed Gene) en cada tratamiento (hasta 4.143 de los 9.133 anotados en el genoma) y con similitudes y diferencias en los tratamientos. Se realizó un análisis del enriquecimiento funcional en ontologías génicas (GO) de los DEGs, para lo que ha sido necesaria la mejora de la anotación funcional disponible del genoma de P. digitatum. Como resultado de este trabajo, se han obtenido genes y procesos potencialmente implicados en la actividad de AfpB y que podrán ser validados experimentalmente en el futuro. Como ejemplo, el gen PDIG_81760 que es el más inducido por la exposición continua de la proteína y que codifica una pequeña proteína secretable, rica en cisteínas, aniónica y con una estructura repetitiva muy peculiar, la cual podría antagonizar la acción de las AFPs catiónicas.

[EN] Infections caused by fungi represent an important risk to human health, food production and food security. However, very few antifungal compounds have been introduced into the global fungicide market in recent years. There is thus an urgent need for the development of novel antifungal agents with properties and mechanisms of action different from existing ones. Some filamentous fungi produce and secrete large amounts of AFPs (AntiFungal Proteins) with antifungal activity. These AFPs are small, cationic and rich in cysteines that form disulfide bridges, and have a great biotechnological interest due to their high antifungal activity, specificity and stability. However, its mechanism of antifungal action and its biological function in the producer fungus are largely unknown. In this project, we aim to study the mode of action of the antifungal protein AfpB against the citrus fruit pathogen Penicillium digitatum, from which the protein was identified, through a transcriptomic analysis based on RNA-seq. For this, we made different AfpB treatments on the reference strain P. digitatum CECT 20794 (absence of AfpB, treatment for 1 or 3 hours, and growth in the presence of AfpB) and the genetically modified strain PDSG420, which overproduces the antifungal protein, was also included in the analysis. The effects of the protein on the growth of the fungus were observed in each case. Changes in the transcriptome were determined, obtaining a high number of differentially expressed genes (DEG) in each treatment (up to 4,143 of the 9,133 annotated in the genome), with similarities and differences in the treatments. We made an analysis of the functional enrichment in gene ontologies (GO) of the DEGs, for which the improvement of the available functional annotation of the P. digitatum genome was necessary. As result of this work, genes and processes potentially involved in AfpB activity have been identified and will be validated experimentally in the future. As an example, the gene PDIG_81760 that is the most induced by AfpB and codes for a small, cysteine-rich secreted and anionic protein with a remarkable repetitive structure, that could antagonize the action of cationic AFPs.