Implementation of CRISPR-based gene targeting tools for genome engineering in Plant Synthetic Biology

Abstract

[EN] Synthetic Biology is a novel interdisciplinary field that aims to re-design existing natural biological systems or even to create new ones from an engineering perspective. Modularity, standardization, abstraction, decoupling and orthogonality constitute the mainstays of Synthetic Biology and must be applied to genetic design in a rational and systematic way. Innumerable breakthroughs in sequence-specific nuclease technologies made possible to precisely manipulate plant genomes. These nucleases include meganucleases, zinc-finger nucleases, TALENs or CRISPR/Cas9 and they have become essential tools in Plant Synthetic Biology. The aforementioned technologies allow to generate user-designed organisms by manipulating their genome and expression pattern. Therefore, the natural response of an organism to a specific environment can be improved, taking Synthetic Biology to the next level. One method to efficiently and precisely modify plant genomes involves introducing double-strand breaks produced by sequence-specific endonucleases to stimulate homologous recombination between a donor template and a chromosomal target site. However, precise genome modification remains a challenge due to the low efficiency of homologous recombination, hampering expansion of Plant Synthetic Biology. It was reported that gene-targeting frequency can be further increased by the presence of a high number of repair templates. Bearing this in mind, deconstructed virus strategy, an indispensable tool in Synthetic Biology field, arises as one of the better solution to efficiently deliver both sequence-specific nucleases and repair template. Therefore, it has been postulated that homologous recombination frequency can be enhanced in plant genome using a viral vector strategy. The most powerfulsite-specific nucleases for genome editing are based on CRISPR technology. The easy reprogramming of the system confers a straight-forward, specific and orthogonal strategy to perform targeted genome editing and to turn the CRISPR system into one of the greatest breakthroughs in Synthetic Biology. The recent characterization of new site-specific endonucleases (CRISPR/Cpf1) broadens the range of gene targeting possibilities. Furthermore, the emergence of several DNA assembly elements is key to create standard modular genetic systems facilitating the Synthetic Biology progress and access to scientific community. In this project, the implementation and optimization of a deconstructed virus for the delivery of CRISPR endonucleases and repair template strategy is performed. The functional characterization of this work is implemented using the acetolactate synthase gene (ALS). A single amino acid substitution on the ALS gene confers resistance to several herbicides, including chlorsulphuron, in Nicotiana benthamiana. Finally, genetic constructs are adapted to the GoldenBraid 3.0 standard, one of the most used DNA assembly systems in Plant Synthetic Biology.

[ES] La Biología Sintética es un campo innovador de carácter interdisciplinar que tiene como objetivo rediseñar los sistemas biológicos naturales, así como crear otros nuevos desde una perspectiva ingenieril. Modularidad, estandarización, abstracción, desacoplamiento y ortogonalidad constituyen los pilares fundamentales de la Biología Sintética y deben ser considerados en el diseño genético de una manera racional y sistemática. La manipulación precisa del genoma de organismos vegetales ha sido posible gracias a los innumerables avances en las tecnologías basadas en nucleasas específicas de secuencia. Las meganucleasas, nucleasas con dedos de zinc, TALEN o CRISPR/Cas9 se han convertido en herramientas esenciales en Biología Sintética de Plantas que permiten generar organismos a la carta manipulando su genoma y patrón de expresión. De este modo, es posible mejorar la respuesta natural de un organismo frente a un entorno específico impulsando el avance de la Biología Sintética. Un método para modificar de forma eficiente y precisa el genoma de las plantas se basa en la rotura de la doble cadena de ADN por endonucleasas específicas de sitio con el objetivo de estimular la recombinación homóloga entre una secuencia molde y el sitio cromosómico específico. Sin embargo, la modificación precisa del genoma vegetal sigue siendo un desafío debido a la baja eficiencia de la recombinación homóloga, dificultando así la expansión de la Biología Sintética de Plantas. En recientes estudios se ha demostrado que este evento se puede favorecer al incrementarse el número de copias de la secuencia molde. Por este motivo, surge la estrategia basada en el empleo de un virus deconstruido como una de las mejores soluciones para entregar de forma eficiente las endonucleasas y las múltiples copias de la secuencia molde. Por lo tanto, se ha postulado que la frecuencia de recombinación homóloga en el genoma de la planta puede potenciarse usando la estrategia basada en el virus deconstruido. Por último, la existencia de diferentes métodos de ensamblaje de ADN permite la creación de sistemas genéticos modulares y estándares que facilitan el progreso de la Biología Sintética y el acceso a toda la comunidad científica. Las nucleasas específicas de sitio más potentes para la edición del genoma se basan en la tecnología CRISPR. La sencilla reprogramación del sistema permite una actuación directa, específica y ortogonal para realizar editado genómico convirtiendo así el sistema CRISPR en uno de los mayores avances en Biología Sintética. La reciente caracterización de nuevas endonucleasas (CRISPR/Cpf1) amplía el rango de posibilidades de la edición genética. Este proyecto muestra la implementación y la optimización de un virus deconstruido para la entrega de las endonucleasas del sistema CRISPR y la secuencia molde, permitiendo así la edición génica basada en recombinación homóloga. La caracterización funcional de este trabajo se ha llevado a cabo empleando el gen de la acetolactato sintasa (ALS) donde un único cambio aminoacídico confiere a Nicotiana benthamiana resistencia a varios herbicidas, incluyendo clorsulfurón. Finalmente, todas las construcciones genéticas han sido adaptadas al estándar GoldenBraid 3.0, uno de los sistemas de ensamblaje más empleados en Biología Sintética de Plantas.