Caracterización de la sobreexpresión de los receptores ALK2 (ACVR1) y ALK6 (BMPR1B) en células madre neurales

Abstract

[EN] The aim of this TFG is to characterize the overexpression`s effect of two serine-threonine kinase receptors, specifically ALK2 and ALK6, in stem cells and neural progenitors’ cultures (NSPCs) derived from adult rat hippocampus, due to their putative implication in the neuronal maturation process. In order to achieve this aim, two commercial plasmids were acquired with the constitutively active forms’ cDNA of ALK2 (ALK2Q207D) and ALK6 (ALK6Q203D). Once the inserts of these plasmids were isolated and purified, they were subcloned into a new vector of viral nature. In this project, retroviruses with ALK6Q203D overexpression and lentiviruses with ALK2Q207D overexpression were obtained. To characterize these two receptors overexpression’s effect, the rat NSPC cell line HC7 was infected with the viral particles obtained and, while inducing their differentiation with retinoic acid /forskolin, the cells were treated with BMP6 protein. Using immunocytochemistry techniques and confocal microscopy analysis, we show that ALK2Q207D and ALK6Q203D overexpression increased NSPC differentiation. The neuronal arborization was quantified with a Sholl Analysis, which verified that the neurons transduced with the viral particles that overexpressed the desired genes, were morphologically more complex than the established controls.

[ES] El objetivo de este TFG es caracterizar el efecto de la sobreexpresión de dos receptores serina treonina de BMPs, concretamente ALK2 y ALK6, en cultivos de células madre y progenitores neurales (NSPCs) derivados del hipocampo adulto de rata, dada su posible implicación en el proceso de maduración neuronal. Para ello, se adquirieron dos plásmidos comerciales con los cDNA de las formas constitutivamente activas de ALK2 (ALK2Q207D) y ALK6 (ALK6Q203D). Se aislaron y purificaron los insertos de dichos plásmidos y se subclonaron en un nuevo vector de origen viral. En este proyecto, se obtuvieron retrovirus para la sobreexpresión de ALK6Q203D y lentivirus para la sobreexpresión de ALK2Q207D. Para ensayar el efecto de la sobreexpresión de este tipo de receptores, se infectaron células de la línea de NSPCs de rata HC7 con las partículas virales obtenidas e induciendo su diferenciación con ácido retinoico/forskolina, se sometieron a un tratamiento con la proteína BMP6. Por técnicas inmunocitoquímicas y análisis de microscopía confocal, se determinó que la sobreexpresión tanto de ALK2Q207D como de ALK6Q203D aumentan la diferenciación de las células NSPCs. La arborización neuronal se cuantificó mediante un análisis de Sholl, comprobándose que las neuronas transducidas con las partículas virales que sobreexpresaban los genes de interés eran más complejas morfológicamente respecto a los controles establecidos.