Puesta a punto del protocolo Agrobest para expresión transitoria de genes en Arabidopsis mediante agroinfección

Abstract

[EN] Transient gene expression via Agrobacterium-mediated DNA transfer is a simple, rapid, versatile and economic technique widely used for the study of gene function, protein localization, protein-protein interaction and protein dynamics. Although there is a large range of platforms in which this technique could be applied, Agrobacterium-mediated leaf infiltration in Nicotiana benthamiana is the preferred approach, since it provides results in a matter of days without the requirement of complex and expensive materials. However, typical transient expression assays use 4 to 5 week-old-plants to perform agroinfiltration, which extends the time required to carry out these experiments. Also, it is reported that the native activity and interaction of some genes from other model organisms, such as Arabidopsis thaliana, could be influenced by their heterologous expression in N. benthamiana plants. Alternatively, A. thaliana has been used worldwide as the dicotyledon model species of choice based on its short generation time, minimal handling, small size and the public availability of mutant lines covering a large proportion of the genome. Nevertheless, until 2008, the use of this platform had been mainly limited to the generation of stable transgenic plants. The implementation of methods for the transient transformation of four-day-old A. thaliana seedlings did minimize the time, manipulation and price of the overall process. Still, some implementations in the existing protocols were required to improve the reproducibility of the process. In 2014, Erh-Min Lai and her team developed the AGROBEST protocol which enables significantly higher expression levels as compared to previously established protocols. This method implements the use of AB-MES medium in both A. tumefaciens pre-induction and co-culture infection process and suppresses the use of the phytotoxic surfactants. However, its main improvement is the use of a A. tumefaciens strain which significantly increases the transformation efficiency when compared with the use of other strains. The aim of this study is to compare the quality and efficiency of transient expression using the AGROBEST protocol to transform A. thaliana seedlings in parallel with the well-established agroinfiltration method in N. benthamiana plants using identical expression plasmids. This technique has been carried out using cytosolic or nuclear fluorescent proteins, but proteins with alternate subcellular localizations have so far not been tested. In the present study, we optimize the novel AGROBEST methodology for the transient expression of both organelle marker proteins and a plasma membrane protein and will determine whether the expression pattern is comparable to those performed with N. benthamiana. Puesta a punto del protocolo Agrobest para expresión transitoria de genes en Arabidopsis mediante agroinfección

[ES] La expresión transitoria a través de la infección mediada por Agrobacterium tumefaciens es una técnica simple, rápida, versátil y económica ampliamente utilizada para el estudio de la función de genes de interés, localización, interacción proteína-proteína y dinámica de proteínas. Aunque existe una gran variedad de soportes en los que se puede aplicar esta técnica, la agroinfiltración de hojas en Nicotiana benthamiana es la más usada con diferencia ya que proporciona resultados en cuestión de días sin la necesidad de usar instrumentación compleja o costosas. Sin embargo, los ensayos de expresión transitoria requieren de plantas de 4 a 5 semanas de edad, lo que ralentiza en gran medida la obtención de resultados. Además, la expresión genes de otros organismos modelo tales como Arabidopsis thaliana podrían verse influenciados por su expresión heteróloga en plantas de N. benthamiana. Alternativamente, A. thaliana se ha utilizado en todo el mundo como la especie modelo de dicotiledóneas debido a su corto tiempo de generación, mínimo manejo en el invernadero, pequeño tamaño y la disponibilidad de líneas mutantes las cuales cubren una gran proporción del genoma. Sin embargo, hasta 2008, el uso de esta plataforma estaba limitado principalmente a la generación de plantas transgénicas estables. La implementación de métodos para la transformación transitoria de plántulas de A. thaliana de cuatro días redujo al mínimo el tiempo, la manipulación y el precio del proceso general. En 2014, Erh-Min Lai y su equipo desarrollaron el protocolo AGROBEST, el cual permite niveles de expresión significativamente mayores que los anteriores protocolos. Este método implementa el uso de medio AB-MES en el proceso de preinducción e infección de cocultivo con A. tumefaciens y suprime el uso del tensioactivo silwet L-77, el cual es fitotóxico. Además, usa una cepa modificada de A. tumefaciens que permite aumentar el rendimiento de transformación en comparación con el uso de otras cepas. El objetivo de este estudio, por tanto, es comparar directamente la eficiencia de la expresión transitoria utilizando el protocolo AGROBEST para transformar plántulas de A. thaliana en paralelo con el método de agroinfiltración bien establecido en plantas de N. benthamiana utilizando plásmidos de expresión idénticos. Hasta hoy, esta técnica se había llevado a cabo solo utilizando proteínas fluorescentes citosólicas o nucleares, pero no se había probado con las proteínas con localizaciones subcelulares alternativas. En el presente estudio nosotros optimizamos el protocolo de transformación transiente mediado por AGROBEST, para expresar tanto marcadores de orgánulos subcelulares como una proteína de membrana. Hasta hoy, esta técnica se había llevado a cabo solo utilizando proteínas fluorescentes citosólicas o nucleares, pero no se había probado con proteínas con localizaciones subcelulares alternativas. En el presente estudio optimizaremos el protocolo de transformación transiente mediado por AGROBEST, para expresar tanto marcadores de orgánulos subcelulares como una proteína de membrana. Además, determinamos si los patrones de expresión son comparables con lo observado en N. benthamiana.