Reconstrucción de un modelo de epitelio oviductal para el soporte del desarrollo embrionario

Abstract

[ES] El oviducto participa en los procesos de transporte de gametos y embriones, fecundación y desarrollo embrionario temprano gracias a la actividad secretora y motilidad ciliar de sus células epiteliales (OECs). Por todo ello, el cultivo de OECs ha sido objeto de estudio para comprender la fisiología y la estructura tridimensional del oviducto y de qué modo contribuye a estos procesos de la biología reproductiva. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar e iniciar el cultivo primario de células oviductales de conejo (ROECs) con la finalidad de reconstruir un modelo oviductal in vitro y evaluar el potencial de éste para mejorar el desarrollo embrionario temprano. Para alcanzarlo, en primer lugar se evaluó el rendimiento y viabilidad de las células epiteliales obtenidas mediante la digestión enzimática con colagenasa, pronasa y tripsina de la fracción ampular de oviductos de conejas inducidas a ovular 24, 48 o 72 horas antes. Una vez seleccionado la enzima, se estudió la viabilidad y características del cultivo de las células congeladas o no sobre las células obtenidas de los tres tipos de oviductos y, se analizó la expresión de los genes OVGP-1 y OCT4 a tiempo 0, 2 días y 7 días de los cultivos procedentes de células congeladas o no de oviductos de 24h. Finalmente, se utilizó el cultivo primario de ROECs de oviductos de conejas para estimar su efecto directo o de un medio condicionado sobre el desarrollo de embriones en estadio de pronúcleo y 2 células . De los resultados obtenidos cabe destacar que la digestión con tripsina de los oviductos de 24h antes permite alcanzar un mayor rendimiento y una viabilidad celular suficiente para el cultivo primario de ROECs (en torno a 556.000 células/ml y 60 % de viabilidad), no observándose diferencias en términos de periodo de confluencia y del mantenimiento del movimiento ciliar (5,9 y 6,9 días respectivamente). La digestión con pronasa redujo sensiblemente la viabilidad de las células de conejas de oviductos ovuladas 72h antes (51%). La congelación de las ROECs no mermó su viabilidad, aunque tanto el periodo en el que alcanzan la confluencia celular y el de mantenimiento de actividad ciliar se vieron afectados negativamente. Por otra parte, la expresión del gen de la oviductina (OVGP-1) fue similar tanto en las ROECs congeladas como en las no congeladas, reduciendo rápidamente su expresión, indicando un posible proceso de desdiferenciación que ya es evidente a los 2 días de cultivo. Por el contrario, la expresión de OCT-4 estuvo afectada por el proceso de congelación, observándose un patrón de expresión diferencial en los primeros 2 días de cultivo. La caracterización de la capacidad proliferativa de las ROECs a través de su PDL fue baja, alcanzando el valor de 7 a 12 días de cultivo en las células procedentes de oviductos de 72h. Por último, tanto el co-cultivo de ROECs como el cultivo con un medio condicionado por ROECs mejoraron la tasa de desarrollo embrionario entre un 15 y un 18%, demostrando la contribución de las secreciones de las ROECs al desarrollo embrionario temprano.

[EN] Oviduct epithelial cells (OECs) are involved in several processes such as gamete and embryo transport, fertilization and early embryo development due to its secretory activity and cilia motility and beating. Therefore, OECs culture has been subject of study in order to understand oviduct physiology, its three-dimensional structure and how it contributes to reproduction biological processes. Thus, the aim of the present study was to establish and characterise a primary culture of rabbit oviductal epithelial cells (ROECs) with the purpose of reconstructing an in vitro oviduct model and evaluate its ability to improve early embryonic development. To reach this purpose, first of all, cell yield and viability were evaluated in isolated epithelial cells obtained through enzymatic digestion with collagenase, pronase and trypsin from ampullae fraction of oviducts deriving from female rabbits which were stimulated to ovulate 24, 48 or 72 hours before. Once the best digestive enzyme was selected, viability and culture characteristics were evaluated in frozen and not frozen ROECs. Moreover, gene expression of OVGP and OCT-4 was analysed in cultured cells at 0, 2 and 7 days for both groups (frozen and fresh cells) of 24h oviducts. Finally, ROECs primary culture and ROECs conditioned culture medium were used to determine their direct effect on early embryonic development. After the study, it’s remarkable that trypsine digestion in oviducts from rabbits which were stimulated to ovulate 24h before showed a higher cell yield and an enough cell viability to develop a primary ROECs culture (around 556.000 cells/ml and 60% viable cells), while no differences were observed in time spent to reach confluence and cilia motility maintenance (5,9 and 6,9 days, respectively). Pronase digestion significantly reduced viability of ROECs from oviducts of rabbits stimulated to ovulate 24h before (51%), while cell viability was not affected by ROECs freezing, which were able to stablish a primary culture. However, time spent to reach confluence and cilia motility maintenance were adversely affected. Likewise, OVGP-1 expression was similar in frozen and fresh ROECs. OVGP-1 expression was immediately reduced, which may indicate a possible dedifferentiation event, being appreciable 2 days after culture initiation. By contrast, OCT-4 expression was affected by freezing, as a differential expression pattern was observed at the first 2 days of culture. Proliferative potential of ROECs was evaluated by PDL, which reached values of 7 to 12 days of culture in ROECs from rabbits estimulated 72h before. Finally, both ROECs co-culture with embryos and ROECs conditioned culture medium with embryos improved early embryo development rate between 15% and 18%, demonstrating that ROECs secretions contribute to early embryo development.