Modulación de la hidrofobicidad de superficies de fibra de vidrio como mejora para el desarrollo de inmunoensayos heterogéneos

Abstract

[ES] En el presente trabajo se propone el empleo de fibras de vidrio como un soporte sólido para reacciones de reconocimiento molecular, en especial interacciones proteína-proteína. Como prueba de concepto, se ha escogido la interacción biotina-estreptavidina. Con este fin, se modificará la hidrofobicidad de superficies de microfibra empleando diversos alquenilsilanos con diversa longitud de cadena, bien sea individualmente o mezclados con un fluoroalquenilsilano a diferentes porcentajes. A continuación, se fijarán a la superficie matrices de gotas de una biotina tiolada mediante la reacción fotoquímica del tiol-eno. Finalmente, se llevará a cabo una reacción entre la Streptavidina-Cys5 y la biotina anclada, y la imagen de los puntos de fluorescencia obtenidos será apropiadamente tratada para obtener la intensidad, tamaño y SNR (señal sobre ruido) de los mismos. Los resultados nos permitirán estudiar cómo la hidrofobicidad afecta a las señales obtenidas en las diferentes superficies, aumentando la calidad de los puntos según las superficies se vuelven más hidrofóbicas, debido bien al uso de un silano más hidrofóbico (cadena más larga) o bien a la adición del fluoroalquenilsilano. Los valores del ángulo de contacto (WCA), la intensidad de la señal y su SNR nos permitirán comparar diferentes tratamientos de superficie y comprobar su viabilidad en procesos de reconocimiento molecular. Para verificar su aplicabilidad en el ámbito de los biosensores, se empleará un segundo esquema: la adaptación a un inmunoensayo heterogéneo indirecto típico. En este caso, un anticuerpo policlonal antibiotina de ratón reaccionará con la biotina tiolada fijada a las superficies por la reacción tiol-eno y seguidamente se aplicará un anticuerpo secundario antirratón marcado con Alexa-fluor 647. La imagen obtenida se tratará para determinar la calidad de las señales obtenidas. Los resultados permitirán estudiar cómo la hidrofobicidad afecta a las señales conseguidas en las diferentes superficies examinadas, mostrando cómo estas superficies pueden ser usadas en aplicaciones biológicas.

[EN] In this work it is proposed the use of glass fibers as solid support for biomolecular recognition reactions, especially protein-protein interactions. As a proof of principle the interaction biotin-streptavidin has been chosen. For this, wettability of fiber surfaces will be modified either using individual alkenyl silanes (with different chain length) or the same alkenyl silanes mixed with a fluoroalkenyl silane at different percentages. Next, arrays of a thiol-biotin derivative will be anchored by means of the photochemical click thiol-ene reaction on the surfaces. Finally, streptavidin-Cy5 will be allowed to react with the anchored biotin and the image of the fluorescence spots attained will be appropriately treated to achieve their intensity, size and SNR. Results will allow to study how hydrophobicity affects signals attained on the different surfaces, improving the quality of the spots as the surfaces becomes more hydrophobic, due to the use of a more hydrophobic silane (longer chain) or to the addition of the fluoroalkenyl silane. Water contact angle (WCA), intensity of signal and signal to noise ratio (SNR) values will allow to compare different surface treatments and show their feasibility in biomolecular recognition events. To verify the application of these surfaces in biosensing fields, a second scheme will be used: a typical indirect heterogeneous immunoassay arrangement. In this case, a rabbit anti-biotin polyclonal antibody will be allowed to react with the biotin anchored to the derivatized surfaces using the photochemical click thiol-ene reaction, and, subsequently, a secondary alexa-fluor 647 labelled goat anti-rabbit will be applied. The attained image will be adequately treated to evaluate the quality of the signals achieved. Results will allow studying how hydrophobicity affects the signal achieved on the different surfaces tested showing how these surfaces can be used in biological applications.