SISTEMA DE CULTIVO PARA MEJORAR LA VIABILIDAD DE EMBRIONES BOVINOS PRODUCIDOS IN VITRO

Abstract

El objetivo general de este trabajo de tesis doctoral fue optimizar un sistema de cultivo para mejorar la calidad y la viabilidad de embriones bovinos in vitro. En primer lugar, evaluamos los efectos de la eliminación de proteína sobre el desarrollo de blastocitos durante un período corto de cultivo individual. La viabilidad del embrión a diferentes plazos fue analizada mediante supervivencia a la criopreservación y recuento diferencial de células embrionarias; porcentajes de gestación; y duración de la gestación, peso y morfometría de los terneros nacidos. Además, se realizó un análisis de expresión génica en blastocistos expandidos de día 7 tanto antes como después de la criopreservación. De este capítulo se puede concluir que el cultivo de embriones individuales durante 24 h en un medio libre de proteína produce menos blastocistos pero aumenta los porcentajes de nacimiento después de la vitrificación y la transferencia a receptoras. A continuación se abordó la evaluación de la viabilidad de los blastocistos expandidos producidos en función de la cinética del embrión y la restricción de proteína durante un periodo corto en cultivo individual. Así, las mórulas y los blastocistos tempranos de día 6 se cultivaron individualmente con y sin proteína durante 24 h. El desarrollo y el contenido de lípidos se analizaron en blastocistos expandidos derivados de mórulas (M-XB) y de blastocistos tempranos (EB-XB). La expresión de genes implicados en el metabolismo lipídico, las respuestas al estrés y la apoptosis se analizaron en M-XB frescos y vitrificados, producidos con y sin proteína. Los índices de gestación, los porcentajes de nacimientos y el peso al nacimiento se registraron después de la transferencia de embriones. Los resultados indican que la cinética embrionaria y la vitrificación impactan en los fenotipos al nacimiento, al menos en el subconjunto de las terneras. Las alteraciones pueden involucrar la proteína exógena y la movilización de las reservas de lípidos. Posteriormente, se investigó si una concentración muy baja de FCS (0.1%) en cultivo desde el día 1 hasta el día 6 podría mejorar los porcentajes de blastocisto temprano (EB) y, a continuación, aumentar los porcentajes de blastocisto expandido (XB) en día 7 después de un cultivo individual sin proteína. La calidad de los embriones producidos se evaluó en términos de supervivencia a la criopreservación, porcentaje de apoptosis, acumulación de lípidos y transferencia a receptoras. Se concluye en este capítulo que la concentración mínima de FCS mejora los porcentajes de EB en el Día 6, permitiendo obtener más XB después de 24h de cultivo individual sin proteína. La calidad de los XB producidos con FCS es similar a los XB producidos con BSA en términos de apoptosis, acumulación de lípidos e índice de gestación. Finalmente, el objetivo en el cuarto capítulo fue cuantificar la proteína total HDGF en el fluido uterino (FU) mediante multiple reaction monitoring (MRM), técnica que permite reconocer la proteína total. Además, analizamos los efectos de rHDGF en etapas embrionarias específicas con embriones bovinos de día 6 cultivados in vitro con y sin proteína (BSA); y sobre la viabilidad de la preñez y los fenotipos de los terneros después de la transferencia de embriones a receptoras. Además, se cuantificó el ARNm de HDGF en células endometriales cocultivadas con un embrión macho o un embrión hembra. De este capítulo se puede concluir que el HDGF total cuantificado por MRM tendió a aumentar en el FU sin embriones, mientras que el sexo del embrión podría regular la expresión endometrial de HDGF. Sin embargo, se debe ser cauteloso con el uso de suplementos macromoleculares específicos en cultivo, ya que pueden contener el GF en estudio, como ocurre con la presencia de HDGF en la BSA comercial, lo que puede alterar los resultados de los experimentos. En última instancia, el uso d

The aim of this thesis was to optimize an embryo culture system in order to improve quality and viability of in vitro bovine embryos. First, we evaluated the effects of protein removal during a short period of individual culture on blastocyst development. Embryo viability was analyzed at different terms through survival to cryopreservation and differential cell counts; pregnancy rates and gestation length, weight and morphometry of calves born. In addition, gene expression analysis was performed on Day-7 expanded blastocysts both before and after cryopreservation. From this work it may be concluded that individual embryo culture for 24 h in a protein-free medium, reduced Day-7 expanded blastocyst rates but improved birth rates after vitrification and transfer to recipients. Next, we evaluated how embryo kinetics and protein restriction during a short step in individual culture would affect the viability of the expanded blastocyst produced. Thus, Day-6 morulae and early blastocysts were cultured individually with and without protein for 24 h. Development and lipid content were analysed in expanded blastocysts derived from morulae (M-XB) and from early blastocysts (EB-XB). Expression of genes involved in lipid metabolism, stress responses and apoptosis was analysed in fresh and vitrified/warmed M-XB produced with and without protein. Pregnancy rates, birth rates and calf birthweight were recorded after transfer of embryos. The results indicate that embryonic kinetics and vitrification impact birth phenotypes, at least in females. Alterations might involve exogenous protein and mobilisation of lipid stocks. Subsequently, we investigated whether very low FCS concentration (0.1%) in culture from Day-1 to Day-6 would improve early blastocyst (EB) rates and, subsequently, increase expanded blastocyst (XB) rates on Day-7 after single culture in protein-free medium. The quality of the produced embryos was evaluated in terms of survival to cryopreservation, apoptosis percentage, lipid accumulation and transfer to recipients. In conclusion, minute FCS concentration improves EB rates on Day-6 leading, after 24h of single culture without protein, to more XBs. The quality of XB produced with FCS compares well with XB produced with BSA in terms of apoptosis, lipid accumulation and pregnancy. Finally, the aim of the last chapter was quantify total HDGF protein in uterine fluid (UF) by multiple reaction monitoring (MRM), and analysed effects of rHDGF on specific embryonic stages with Day-6 bovine embryos cultured in vitro with and without protein (BSA), and on pregnancy viability and calf phenotypes after embryo transfer to recipients. In addition, mRNA abundance of HDGF in endometrial cells co-cultured with one male or one female embryo was quantified. From this chapter it may be concluded that total HDGF quantified by MRM tended to increase in UF without embryos, and that HDGF endometrial expression can be regulated by embryonic sex. Furthermore, rHDGF acts selectively on specific embryonic stages. Nevertheless caution is advised when adding specific macromolecular supplements in culture. It cannot be ruled out that the GF under study can be present in such supplements as verified with HDGF presence in commercial BSA. Small GF traces can alter experimental results. Ultimately, the use of rHDGF is compatible with pregnancy and birth of normal calves.

L'objectiu general d'este treball de tesi doctoral va ser optimitzar un sistema de cultiu per a millorar la qualitat i la viabilitat d'embrions bovins in vitro. En primer lloc, vam avaluar els efectes de l'eliminació de proteïna sobre el desenvolupament de blastocists durant un període curt de cultiu individual. La viabilitat de l'embrió a diferents terminis va ser analitzada per mitjà de la supervivència a la criopreservació i recompte diferencial de cèl¿lules embrionàries; percentatges de gestació; i duració de la gestació, pes i morfometria dels vedells nascuts. A més, es va realitzar un anàlisi d'expressió gènica en blastocists expandits de dia-7 tant abans com després de la criopreservació. D'este capítol es pot concloure que el cultiu d'embrions individuals durant 24 h en un medi lliure de proteïna produeix menys blastocists però augmenta els percentatges de naixement després de la vitrificació i la transferència a receptores. A continuació es va abordar l'avaluació de la viabilitat dels blastocists expandits produïts en funció de la cinètica de l'embrió i la restricció de proteïna durant un període curt en cultiu individual. Així, les mòrules i els blastocists primerencs de dia 6 es van cultivar individualment amb i sense proteïna durant 24 h. El desenvolupament i el contingut de lípids es van analitzar en blastocists expandits derivats de mòrules (M- XB) i de blastocistos primerencs (EB-XB). L'expressió de gens implicats en el metabolisme lipídic, les respostes a l'estrès i l'apoptosi es van analitzar en M-XB frescs i vitrificats, produïts amb i sense proteïna. Els índexs de gestació, els percentatges de naixements i el pes al naixement es van registrar després de la transferència d'embrions. Els resultats indiquen que la cinètica embrionària i la vitrificació impacten en els fenotips al naixement, almenys en el subconjunt de les vedelles. Les alteracions poden involucrar la proteïna exògena i la mobilització de les reserves de lípids. Posteriorment, es va investigar si una concentració molt baixa de FCS (0.1%) en cultiu des del dia 1 fins al dia 6 podria millorar els percentatges de blastocists primerenc (EB) i, a continuació, augmentar els percentatges de blastocists expandits (XB) en dia 7 després d'un cultiu individual sense proteïna. La qualitat dels embrions produïts es va avaluar en termes de supervivència a la criopreservació, percentatge d'apoptosi, acumulació de lípids i transferència a receptores. Es conclou en este capítol que la concentració mínima de FCS millora els percentatges d'EB en el Dia 6, permetent obtindre més XB després de 24h de cultiu individual sense proteïna. La qualitat dels XB produïts amb FCS és semblant als XB produïts amb BSA en termes d'apoptosi, acumulació de lípids e índex de gestació. Finalment, l'objectiu en el quart capítol va ser quantificar la proteïna total HDGF en el fluid uterí(FU) per mitjà de multiple reaction monitoring (MRM), tècnica que permet reconèixer la proteïna total. A més, analitzem els efectes de rHDGF en etapes embrionàries específiques amb embrions bovins de Dia-6 cultivats in vitro amb i sense proteïna (BSA); i sobre la viabilitat del prenyat i els fenotips dels vedells després de la transferència d'embrions a receptores. A més, es va quantificar l'ARNm de HDGF en cèl¿lules endometrials cocultivades amb un embrió mascle o un embrió femella. D'este capítol es pot concloure que el HDGF total quantificat per MRM va tendir a augmentar en l'FU sense embrions, mentre que el sexe de l'embrió podria regular l'expressió endometrial de HDGF. No obstant això, s'ha de ser cautelós amb l'ús de suplements macromoleculars específics en cultiu, ja que poden contindre el GF en estudi, com ocorre amb la presència de HDGF en la BSA comercial, la qual cosa pot alterar els resultats dels experiments. En última instància, l'ús de rHDGF és compatible amb la gestació i el na