Design of smart scaffolds for the treatment and prevention of bone infection

Abstract

La presente tesis doctoral, titulada "Diseño de scaffolds inteligentes para la prevención y tratamiento de la infección ósea", se centra en el desarrollo de materiales híbridos orgánico-inorgánicos capaces de realizar una liberación controlada de fármacos con fines biomédicos.

En el primer capítulo, se presenta una introducción general sobre química supramolecular, materiales híbridos orgánico-inorgánicos y materiales porosos.

En el segundo capítulo, se presentan tres proyectos sobre el diseño de puertas moleculares. En el primero, se muestran dos sistemas basados en el uso de un vidrio mesoporoso que actúa como soporte inorgánico, cargado y funcionalizado con moléculas orgánicas para llevar a cabo una liberación controlada de sustancias. La primera puerta molecular está compuesta por aminas y adenosín 5'-trifosfato (ATP), y la segunda está formada por 3-(trietoxisilil)propilisocianato unido a polímeros de ε-poli-L-lisina. Los dos sistemas se han caracterizado por resonancia magnética nuclear en estado sólido (RMN) y espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). También se han estudiado las propiedades bioactivas de ambos materiales. Después, ambas puertas moleculares se han implementado en sólidos cargados con el objetivo de demostrar se podía realizar una liberación controlada de la carga. En el primer caso, el soporte mesoporoso se ha cargado con doxorubicina y se ha tapizado con moléculas de ATP. El sistema se ha validado in vitro con células humanas de osteosarcoma (HOS). En el segundo caso, el soporte mesoporoso se ha cargado con levofloxacino y se ha tapizado con ε-poli-L-lisina, y el sistema se validado con bacterias E.coli.

Una vez descritos estos sistemas, se presenta una segunda publicación donde también se utiliza la puerta molecular de ATP. En este caso, el vidrio mesoporoso bioactivo que actúa como soporte inorgánico tiene una composición de 80%SiO2-15%CaO-5%P2O5, y se ha cargado con levofloxacino con el objetivo de conseguir propiedades antibióticas. El sólido se ha caracterizado mediante las técnicas correspoondientes, y se han estudiado sus propiedades bioactivas. Finalmente, se han utilizado bacterias E.coli para demostrar que el sólido posee actividad antibiótica, y es capaz de llevarala a cabo solo en presencia de fosfatasa ácida.

El tercer proyecto presentado consiste en un soporte de MCM-41cargado con un colorante y funcionalizado con una secuencia peptídica que actúa como puerta molecular. El estímulo usado en este caso es la proteasa V8, típica del microorganismo S. aureus. El sistema ha sido correspondientemente caracterizado, y se han testado sus propiedades de liberación controlada de sustancias in vitro, demostrando la eficiencia del diseño.

En el tercer capítulo, se utiliza un derivado de un componente de aceites esenciales (vanillina) para funcionar microesferas y scaffolds de fosfato de calcio, para dotarlos de propiedades antibióticas. En primer lugar, se ha sintetizado y se ha caracterizado el compuesto derivado de la vanillina, y se ha anclado en la superficie de los materiales de fosfato cálcico. Después, se han estudiado las propiedades antimicrobianas de ambos materiales en presencia de bacterias E.coli. También se han llevado a cabo ensayos de citotoxicidad con células tipo-fibroblasto L929 ynsayos de biocompatibilidad con células humanas tipo-osteoblasto MG-63, demostrando que las propiedades osteoregenerativas de los materiales originales no se ven modificadas tras el proceso de funcionalización.

En resumen, se puede concluir que los resultados obtenidos a lo largo de esta tesis han contribuido al campo de los materiales de liberación controlada y de los materiales con efecto antibactérico. Estos nuevos diseños pueden ser clave en futuras aplicaciones para la investigación biotecnológica y biomédica, particularmente en terapias para la regeneración y contra la infección ósea.

This thesis, entitled "Design of smart scaffolds for the treatment and prevention of bone infection", is focused on the development of smart organic-inorganic hybrid materials capable of perform controlled-delivery of drugs with biomedical purposes.

In the first chapter, a general introduction about supramolecular chemistry, organic-inorganic hybrid materials and porous materials is given. The characterization and applications of porous materials are extensively explained, since those contents are highly related to the developing of this thesis.

In the second chapter, three projects based on the design of gated devices are presented. In the first publication, two gated systems based on the use of a mesoporous silica material as an inorganic support, loaded and functionalised with organic molecules to achieve a controlled drug release are studied. The first molecular gate is composed by amino moieties and adenosine 5'-triphosphate (ATP), and the second one is composed by 3-(triethoxysilyl)propylisocyanate linked to ε-poly-L-lysine polymers. The two systems were characterized by solid state nuclear magnetic resonance (NMR) and Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR). The bioactivity capabilities of the materials were also studied. Then, both molecular gates have been implemented in loaded solids in order to demonstrate their controlled-release capabilities. In a first case, the mesoporous support was loaded with doxorubicin and capped with ATP molecules, and the system has been validated in a human osteosarcoma cell culture test. In a second case, the mesoporous support was loaded with levofloxacin and capped with the ε-poly-L-lysine molecular gates, and the system has been validated with E.coli bacteria.

Once these two systems are described, a second project with the ATP molecular gates is presented. In this case, the mesoporous bioactive glass which acts as support has a composition of 80%SiO2-15%CaO-5%P2O5, and it has been loaded with levofloxacin with the purpose of killing bacteria. The solid has been characterized by corresponding techniques, and its bioactive properties have been studied. Finally, E.coli bacteria have been used to demonstrate that the solid is able to perform an antimicrobial activity only in the presence of acid phosphatase.

The third project consists of a MCM-41 support loaded with a dye and capped with a peptide sequence. The trigger used in this case is the V8 protease, typical of the microorganism S. aureus. The system has been correspondingly characterized, and its drug release properties in vitro have been tested, demonstrating the efficiency of the design.

In the third chapter, calcium phosphate microspheres and scaffolds have been functionalised with an essential-oil component derivative in order to achieve antibacterial properties. First, the vanillin-derivative has been synthesized and characterised, and in a second step, it has been attached to the surface of the calcium phosphate materials. Then, the antimicrobial properties of both materials have been tested against E.coli bacteria. Cytotoxicity assays with L929 fibroblast-like cells have been performed in order to demonstrate that the functionalized scaffolds did not perform a cytototxic effect. Finally, biocompatibility assays have been made with MG-63 human osteoblast-like cells, demonstrating that the functionalization of the scaffolds with vanillin do not affect their osteoregenerative properties.

To sum up, it can be concluded that the results obtained in this thesis have contributed to the field of stimuli-responsive materials and antibacterial devices. The new designs could be key in the development of future applications in biotechology and biomedical research, particularly in bone infection and bone regeneration therapeutics.

La present tesi doctoral, titulada "Disseny de scaffolds intel·ligents per la prevenció i tractament de la infecció òssia", es centra en el desenvolupament de materials híbrids orgànic-inorgànics capaços de realitzar una lliberació controlada de fàrmacs amb propòsits biomèdics.

En el primer capítol, es presenta una introducció general sobre química supramolecular, materials híbrids orgànic-inorgànics i materials porosos. També s'explica extensivament la caracterització i les aplicacions d'aquests materials, ja que estos continguts estan altament relacionats amb el desenvolupament d'aquesta tesi.

En el segon capítol, es presenten tres projectes sobre el disseny de portes moleculars. En el primer, es mostren dos sistemes basats en l'ús d'un vidre mesoporós que actua com a suport inorgànic, carregat i funcionalitzat amb molècules orgàniques per a dur a terme una lliberació controlada de substàncies. La primera porta molecular està formada per amines i adenosín 5'-trifosfat (ATP), i la segona està formada per 3-(trimetoxisilil)propilisocianat unit a polímers de ε-poli-L-lisina. Els dos sistemes s'han caracteritzat per resonància magnètica nuclear en estat sòlid (RMN) i espectroscopia infrarroja per transformada de Fourier (FTIR). També s'han estudiat les propietats bioactives de ambdós materials. Després, ambdues portes moleculars han sigut implementades en sòlids carregats amb l'objectiu de demostrar que es pot realitzar una lliberació controlada de la càrrega. En el primer cas, el suport mesoporós s'ha carregat amb doxorrubicina, i el sistema s'ha validat in vitro amb cèl·lules humanes d'osteosarcoma (HOS). En el segon cas, el suport mesoporós s'ha carregat amb levofloxací i s'ha entapissat amb ε-poli-L-lisina; el sistema s'ha validat amb bacteris E.coli.

Una volta descrits aquests sistemes, es presenta una segona publicació on també s'utilitza la porta molecular d'ATP. En aquest cas, el vidre mesoporós bioactiu que actua com a suport inorgànic té una composició de 80%SiO2-15%CaO-5%P2O5., y s'ha carregat amb levofloxací amb l'objectiu d'aconseguir propietats antibiòtiques. El sòlid s'ha caracteritzat mitjançant les tècniques corresponents, i s'han estudiat les seues propietats bioactives. Finalment, s'han utilitzat bacteris E.coli per demostrar que el sòlid posseïx activitat antibiòtica, i que és capaç de dur-la a terme solament en presència de fosfatasa àcida.

El tercer projecte presentat consisteix en un suport de MCM-41 carregat amb un colorant i funcionalitzat amb una seqüència peptídica que actua com a porta molecular. L'estímul utilitzat en aquest cas és la proteasa V8, típica del microorganisme S. aureus. El sistema ha sigut corresponentment caracteritzat, i s'han testat les seues propietats de lliberació controlada de substàncies in vitro, demostrant l'eficàcia del disseny.

En el tercer capítol, s'ha utilitzat un derivat d'un component d'olis essencials (vanil·lina) per funcionalitzar microesferes i scaffolds de fosfat de calci amb l'objectiu de dotar-los de propietats antibiòtiques. En primer lloc, s'ha sintetitzat y caracteritzat el compost derivat de la vanil·lina, i s'ha unit a la superfície dels materials de fosfat càlcic. Després, s'han estudiar les propietats antimicrobianes d'ambdós materials en presència de bacteris E.coli. S'han dut a terme assajos de citotoxicitat amb cèl·lules tipus fibroblast L929i assajos de biocompatibilitat amb cèl·lules humanes tipus-osteoblast MG-63, demostrant que les propietats osteoregeneratives dels materials originals no es veuen modificades després del procés de funcionalització.

En resum, es pot concluir que els resultats obtinguts en aquesta tesi han contribuït al camp dels materials de lliberació control·lada i materials amb propietats antibacterianes. Els nous dissenys poden ser claus per al desenvolupament de futures aplicacions en la recerca biotecnològica i bi