Estudio de la osmolalidad interna y del medio en el cultivo in vitro de microsporas de Brassica napus

Abstract

Existen diferentes factores que determinan la inducción de la androgénesis en el cultivo de microsporas aisladas. Entre estos factores se encuentran: el fondo genético, las condiciones de la planta donante, el estadio de desarrollo de las microsporas o las condiciones de cultivo in vitro. De entre éstas últimas, el contexto osmótico al que se ven sometidas las células en cultivo podría tener un papel importante, como se sabe que ocurre en otros sistemas de cultivo in vitro e incluso in vivo. Sin embargo, esto no ha sido todavía estudiado. En este sentido, el objetivo del presente trabajo es estudiar por primera vez la evolución de la osmolalidad interna de las microsporas y del medio en cultivos in vitro de microsporas de colza (Brassica napus). Para ello, en primer lugar se determinó el método de homogeneización de las microsporas más eficiente mediante la evaluación de tres métodos previamente aplicados a otros materiales vegetales. Posteriormente, se usó este método para analizar la osmolalidad interna de las microsporas frescas de colza, así como la evolución de la osmolalidad interna de las microsporas y del medio en diferentes puntos a lo largo de la progresión de cultivos de microsporas aisladas. Mediante la comparación de los distintos métodos de homogeneización se concluyó que los valores de osmolalidad de las microsporas frescas dependen del método usado para la extracción del contenido intracelular. De entre los diferentes métodos probados, la aplicación de ciclos frío-calor es el más efectivo, ya que los valores medios de osmolalidad obtenidos son significativamente superiores y, por tanto, ofrece un mayor poder de discriminación entre muestras. En cuanto al estudio de la osmolalidad de las microsporas frescas de colza, se observó que no existen diferencias significativas entre los valores de osmolalidad de las microsporas en diferentes estadios de desarrollo. Por último, se concluyó que las microsporas correspondientes a los intervalos que más responden mantienen su osmolalidad interna de forma mucho más estable que los que responden menos, que acaban igualando las osmolalidades interna y la externa a día 7. Es decir, existe una clara relación proporcional entre el mantenimiento de la osmolalidad interna y la respuesta embriogénica.

There are several factors affecting the induction of androgenesis in microspore culture, such as the genetic background, donor plant conditions, developmental stage of the microspores, or in vitro culture conditions. Among in vitro culture conditions, the osmotic context of cultured cells could play an important role, as it happens in other in vitro and in vivo culture systems. However, this has never been studied before during microspore embryogenesis. In this sense, the objective of the present work is to determine the osmotic changes in both the internal osmolality of microspores and the osmolality of the in vitro culture medium in rapeseed (Brassica napus) microspore culture. First, an efficient method to homogenize microspores was determined by testing three methods previously applied to other plant materials. Then, we used this method to analyze the internal osmolality of freshly isolated microspores and of in vitro cultured microspores and their corresponding culture medium at different stages during culture progression. By comparing different homogenization methods, we concluded that osmolality values of freshly isolated microspores depend on the homogenization method used to extract the intracellular content. Among all the tested methods, the application of several cold-hot cycles is the most effective, because osmolality values were significantly superior to the other methods. Thus, this method would provide more discrimination capacity among samples. Regarding the study of freshly isolated microspores osmolality, no differences between the osmolality values of the consecutive microspore stages of development were observed. Finally, it was concluded that microspores from intervals with more response are more prone to maintain their internal osmolality in a more stable way than microspores with less response, whose intern osmolality equals media osmolality at day 7. In other words, there is a clear and proportional relationship between the maintenance of internal osmolality of microspores and the embryogenic response.