Análisis de la interacción del virus del arabesco del Pelargonium con la ruta de silenciamiento por RNA del huésped

Abstract

[ES] En plantas, el silenciamiento por RNA constituye un potente mecanismo de defensa frente a virus. Los RNA virales de doble cadena activan este tipo de procesos y son digeridos por las enzimas DCL (Dicer-like), cuya acción genera pequeños RNA (sRNA) de entre 20 y 24 nt. Estos sRNA promueven la degradación de RNA de secuencia complementaria a través de un complejo multiproteico conocido como RISC (RNA-induced silencing complex), cuya molécula efectora es una proteína Argonauta (AGO). Con el fin de evadir esta barrera defensiva del huésped, la mayoría de los virus de plantas codifican supresores del silenciamiento por RNA (VSR), cuyos mecanismos de acción son diversos y en muchos casos no se comprenden del todo. Aunque todas las etapas de la ruta de silenciamiento pueden ser inhibidas por los VSR, los sRNA y las proteínas AGO parecen ser las dianas más frecuentes. Se ha postulado que motivos GW/WG podrían ser fundamentales para la actividad de algunos VSR, al intervenir en la interacción con proteínas AGO.

En este trabajo se ha pretendido seguir profundizando en el estudio de la respuesta antiviral en plantas y de los mecanismos de acción de los supresores de silenciamiento. El primer objetivo abordado ha sido identificar el VSR codificado por el virus del arabesco del Pelargonium (Pelargonium line pattern virus, PLPV), un miembro del género Pelarspovirus dentro de la amplia familia Tombusviridae. Los resultados han mostrado que la proteína de cubierta del virus (p37) es capaz de inhibir de manera eficiente el silenciamiento inducido por RNA. La generación de un batería de variantes capaces e incapaces de actuar como VSR y/o de empaquetar el RNA viral mediante mutagénesis dirigida de distintos motivos de la proteína, incluido un motivo GW que está conservado en ortólogos, nos han permitido conocer que: (i) tanto la función de supresión del silenciamiento como la función de encapsidación son esenciales para que el PLPV alcance una infección sistémica y (ii) p37, a pesar de contener un motivo GW funcional e interaccionar con distintas AGO, emplea el secuestro de sRNA como estrategia principal para inhibir el silenciamiento.

A pesar de que ambas funciones conocidas de p37 deben ser llevadas a cabo esencialmente en el citoplasma, esta proteína se localiza en citoplasma y núcleo, con gran acumulación en nucleolo, por lo que nos planteamos como segundo objetivo en este trabajo profundizar acerca de la localización nucleolar de p37. Además de mapear la región de la proteína que contiene la señal de localización nucleolar (NoLS) en los primeros 45 aminoácidos de la molécula, también hemos observado que p37 interacciona con diferentes miembros de la familia de las importinas ¿, adaptadores moleculares del transporte nucleocitoplasmático, y que esta interacción es esencial para la localización nucleolar de la proteína. Adicionalmente, la anulación de la localización nucleolar de p37 mediante el silenciamiento de importinas ¿ ha correlacionado con una disminución de acumulación del virus, lo que sugiere que dicha localización es ventajosa para la infección viral.

Por último, para intentar conocer más datos acerca de las actividades de la ruta de silenciamiento que están implicados en la defensa frente al PLPV, analizamos la infección viral en líneas transgénicas de N. benthamiana con la expresión o actividad distintos componentes de la ruta comprometida. Los resultados han mostrado que DCL4 y, en menor medida, DCL2 afectan a la infección viral y que ambas tienen un efecto aditivo, tal y como se ha descrito en diversas interacciones virus-planta. Adicionalmente, AGO2 se ha revelado como un factor clave en la respuesta frente al PLPV, ampliando el número de virus que están afectados por esta endonucleasa particular. En conjunto, los resultados obtenidos muestran que tanto el procesamiento de dsRNA mediado por enzimas DCL como el corte de RNA mediado AGO, contribuyen a la defen

[CA] En plantes, el silenciament per RNA constitueixen un potent mecanisme de defensa davant virus. Els RNA virals de doble cadena activen aquest tipus de processos, i són digerits per els enzims DCL (Dicer-like), donant lloc a xicotets RNA (sRNA) d'entre 20 i 24 nt. Estos sRNA promouen la degradació de RNA de seqüència complementària a través d'un complex multiproteic conegut com RISC (RNA-induced silencing complex), la molècula efectora del qual és una proteïna Argonauta (AGO). Per tal d'evadir aquesta barrera defensiva de l'hoste, la majoria dels virus de plantes codifiquen supressors del silenciament per RNA (VSR), els mecanismes d'acció dels quals són diversos i en molts casos no es comprenen del tot. Encara que totes les etapes de la ruta poden ser inhibides, els sRNA i les proteïnes AGO semblen ser les dianes més freqüents. S'ha postulat que els motius GW/WG podrien ser fonamentals per a l'activitat d'alguns VSR, en intervindre en la interacció amb proteïnes AGO.

En aquest treball s'ha pretés continuar aprofundint en l'estudi de la resposta antiviral en plantes i dels mecanismes d'acció dels supressors de silenciament. El primer objectiu abordat ha sigut identificar l'VSR codificat pel virus de l'arabesc del Pelargonium (Pelargonium line pattern virus, PLPV), un membre del gènere Pelarspovirus dins de l'amplia família Tombusviridae. Els resultats han mostrat que la proteïna de coberta del virus (p37) és capaç d'inhibir de manera eficient el silenciament induït per RNA. La generació d'una bateria de variants capaces i incapaces d'actuar com VSR i/o d'empaquetar l'RNA viral mitjançant la mutagènesi dirigida de diferents motius de la proteïna, inclòs un motiu GW que està conservat en ortòlegs, ens ha permés conèixer que: (i) tant la funció de supressió del silenciament com la funció d'encapsidació són essencials per a que el PLPV aconseguisca una infecció sistèmica i (ii) p37, malgrat contindre un motiu GW funcional i interaccionar amb diferents AGO, empra el segrest de sRNA com a estratègia principal per a inhibir el silenciament.

Malgrat que ambdues funcions conegudes de p37 han de ser dutes a terme essencialment en el citoplasma, esta proteïna localitza en citoplasma i nucli, amb gran acumulació en nuclèol, per la qual cosa ens hem plantejat com a segon objectiu en este treball aprofundir sobre la localització nucleolar de p37. Ademés de mapejar la senyal de localització nucleolar (NoLS) en els primers 45 aminoàcids de la molècula, també hem observat que p37 interacciona amb diferents membres de la família de les importines ¿, i que aquesta interacció és essencial per a la localització nucleolar de la proteïna. A més, l'anul¿lació de la localització nucleolar de p37 mitjançant el silenciament d'importines ¿ s'ha correlacionat amb una disminució d'acumulació del virus, la qual cosa suggereix que aquesta localització és avantatjosa per a la infecció viral.

Finalment, per a intentar conéixer més dades sobre les activitats de la ruta de silenciament que estan implicats en la defensa front al PLPV, hem analitzat la infecció viral en línies transgèniques de N. benthamiana amb l'expressió o activitat diferents components de la ruta compromesa. Els resultats han mostrat que DCL4 i, en menor mesura, DCL2 afecten la infecció viral i que ambdues tenen un efecte additiu, tal com s'ha descrit en diverses interacciones virus-planta. Addicionalment, AGO2 s'ha revelat com un factor clau en la resposta front al PLPV, ampliant el nombre de virus que estan afectats per aquesta endonucleasa particular. En conjunt, els resultats obtinguts mostren que tant el processament de dsRNA mediat per enzims DCL com el tall d'RNA mediat AGO, contribueixen a la defensa de N. benthamiana front al PLPV.

[EN] n plants, RNA silencing functions as a potent antiviral mechanism. Viral-derived double-stranded RNAs trigger this type of processes, being digested by DCL (Dicer-like) enzymes into virus-derived small RNAs (vsRNAs) of 20-24 nt. These vsRNAs guide sequence-specific RNA degradation upon their incorporation into an RNA-induced silencing complex (RISC) that contains a slicer of the Argonaute (AGO) family. To counteract this host defence response, most plant viruses encode suppressors of RNA silencing (VSRs), whose mechanisms of action are diverse and often not well understood. Though virtually all stages of the antiviral silencing pathway can be blocked by VSRs, sRNAs and AGO proteins seem to be the most common targets. It has been postulated that GW/WG motifs could be fundamental for the activity of some VSRs by directing interaction with AGOs.

In this work, we have pursued to get further insights into the antiviral silencing in plants and the mechanisms of action of silencing suppressors. The first objective has been to identify the VSR encoded by Pelargonium line pattern virus (PLPV), a member of the genus Pelarspovirus within family Tombusviridae. The results have shown that the viral coat protein (p37) is able to efficiently inhibit RNA silencing. Generation of suppressor-competent and incompetent molecules and uncoupling of the RSS and particle assembly capacities through site-directed mutagenesis of some p37 sequence traits, including a conserved GW motif, allowed us to know that: (i) the silencing suppression and encapsidation functions of p37 are both required for systemic PLPV infection and, (ii) p37, even though it has a functional GW motif and interacts with different AGOs, inhibits silencing most likely through vsRNA sequestration.

Despite both p37 functions have to be executed essentially in the cytoplasm, this protein localizes in cytoplasm and nucleus, with high accumulation at the nucleolus, so the second objective of this work has been to gain further insights into the nucleolar localization of p37. Besides mapping the protein region containing the nucleolar localization signal (NoLS) in the first 45 amino acids of the molecule, we have found that p37 interacts with distinct members of the importin ¿ family, main cellular transporters for nucleo-cytoplasmic traffic of proteins, and that these interactions are crucial for nucleolar targeting of p37. In addition, impairment of p37 nucleolar localization through down-regulation of importin ¿ expression has been correlated with a reduction of viral accumulation, suggesting that sorting of the protein to the major subnuclear compartment is advantageous for the infection process.

Finally, in order to obtain information on which activities of RNA silencing pathway are involved in the defense against PLPV, we analyzed the viral infection in N. benthamiana transgenic lines with the functions of distinct components of the pathway impaired. Results have shown that DCL4 and, to lesser extent, DCL2 contribute to restrict viral infection and that they have additive effects, in agreement with that observed in other plant-virus interactions. Additionally, AGO2 was found to be a key factor in the defense against PLPV, extending the number of viruses that are affected by this particular slicer. Altogether, the results supported that both dicing and slicing activities participate in the defense of N. benthamiana against PLPV.