Puesta a punto de la técnica droplet digital PCR para el análisis de variaciones en el número de copias en tumores sólidos

Abstract

[ES] El cáncer es un problema sanitario de primer orden y la segunda causa de muerte en los países desarrollados por detrás de las enfermedades cardiovasculares. Según la OMS, los casos de cáncer han crecido un 28% en los últimos 6 años. En España, en 2018, se ha registrado una incidencia de más de 270.000 casos y una mortalidad de más 110.000, siendo los tipos tumorales más comunes el cáncer de pulmón, mama, colorrectal, próstata y estómago. La caracterización molecular del tejido tumoral basada en la búsqueda de mutaciones somáticas, variaciones en el número de copias y otras alteraciones características de cada tipo tumoral, se ha convertido en una práctica habitual en oncología clínica. La identificación de estas alteraciones ha permitido la aparición de nuevos biomarcadores para el diagnóstico, pronóstico y el tratamiento de la enfermedad. Estas determinaciones se realizan de forma rutinaria en muestras parafinadas de biopsias de tejido tumoral. Sin embargo, la sangre de pacientes con cáncer contiene distintos tipos de materiales que son susceptibles de un análisis molecular detallado: siendo el ADN tumoral circulante libre extracelular (ADNct) el más estudiado. El estudio de estos materiales obtenidos del plasma se conoce como biopsias líquidas y permite obtener información molecular y diagnóstica de relevancia similar a la obtenida mediante biopsias invasivas convencionales. El ADNct deriva de tumores primarios, lesiones metastásicas y de células tumorales circulantes (CTC) lisadas y su aislamiento es mucho más simple que las CTCs. La aplicación de estas técnicas no invasivas supone una revolución en el diagnóstico actual, pronóstico y seguimiento de la enfermedad, beneficiándose tanto pacientes en estadios iniciales como avanzados. En la actualidad se han desarrollado múltiples métodos que nos permiten detectar y evaluar el ADNct, como la secuenciación de nueva generación y varias técnicas de PCR incluida la PCR digital (dPCR). Las técnicas de dPCR son más precisas y la sensibilidad es cada vez mayor llegando a detectar porcentajes de mutación menores de 0,01%. La tecnología droplet dPCR (ddPCR) permite el procesamiento de aproximadamente 2 millones de reacciones de PCR utilizando ensayos TaqMan convencionales. Para ello se encapsulan en gotitas de aceite tanto los reactivos de PCR cómo la muestra de ADN, y dentro de cada una de ellas se da la reacción de PCR. Al final, mediante un citómetro de flujo automatizado se procede a la lectura de la fluorescencia de cada gotita. Las variaciones en el número de copias (CNV) son delecciones o amplificaciones de segmentos del genoma que pueden tener un tamaño de cien hasta varios millones de pares de bases. En los últimos años se ha demostrado la implicación de las CNV en muchas enfermedades, entre ellas el cáncer, dónde además, recientemente se ha visto su importancia en la respuesta a determinados tratamientos. El objetivo de este trabajo es la puesta a punto de la determinación de CNV para distintos genes diana en muestras de diferentes tumores sólidos, tanto en muestras parafinadas como en muestras de biopsias líquidas.

[EN] Cancer is a first order health problem and the second cause of death in the developed countries, behind cardiovascular diseases. According to the WHO, cancer cases have grown 28% in the last 6 years. In Spain, in 2018 there has been an incidence of more than 270,000 cases and a mortality of more than 110,000. The most common are lung, breast, colorectal, prostate and stomach cáncer. The molecular characterization of tumor tissue, which consists of finding somatic mutations, variations in the number of copies and other characteristic alterations of each tumor type, has become a common practice in clinical oncology. The identification of these alterations has allowed the appearance of new biomarkers for the diagnosis, prognosis and treatment of the disease. These determinations are carried out routinely in paraffin samples of tumor tissue biopsies. However, the patients blood contains different types of materials that are amenable to detailed molecular analysis, being the most estudied the extracellular free circulating tumor DNA (cDNA). The study of these materials obtained from plasma is known as liquid biopsies and it allows to obtain relevant molecular and diagnostic information, similar to that obtained by conventional invasive biopsies. The cDNA is derived from primary tumors, metastatic lesions and lysed circulating tumor cells (CTC) and its isolation is much easy than CTCs. The application of these non-invasive techniques represents a revolution in the current diagnosis, in the prognosis and follow-up of the disease, benefiting both patients in the initial and advanced stages. Nowadays, multiple methods have been developed that allow us to detect and evaluate the cDNA, such as next generation sequencing and several PCR techniques including digital PCR (dPCR). The dPCR techniques are more precise and their sensitivity is increasing, reaching detection of mutation percentages less than 0.01%. Droplet dPCR (ddPCR) technology allows the processing of approximately 2 million PCR reactions using conventional TaqMan assays. For this purpose, both the reagents and the DNA sample are encapsulated in oil droplets, within each of which the PCR reaction occurs. At the end, an automated flow cytometer proceeds to read the fluorescence of each droplet. The copy number variation (CNV) are deletions or amplifications of genome segments that can have a size of one hundred to several million base pairs. In recent years, the implication of CNVs has been demonstrated in many diseases, including cáncer, where in addition, its importance in the response to certain treatments has recently been seen. The objective of this work is to tuning the ddPCR technique for CNV determination in different target genes in samples of different solid tumors, both in paraffin samples and in samples of liquid biopsies.