Regulación del estado de fosforilación del regulador de la respuesta PrcR de Lactobacillus casei por la concentración intracelular de acetil-fosfato

Abstract

[ES] Los sistemas de transducción de señal de dos componentes (TCS) están típicamente constituidos por una proteína sensor, normalmente anclada en la membrana celular, y un regulador de la respuesta (RR) citoplásmico que generalmente actúa como regulador transcripcional. La detección de un estímulo específico por parte del sensor activa su autofosforilación y subsiguiente transferencia del grupo fosforilo al RR. El estado de fosforilación de este último modula su actividad reguladora, aumentando o reduciendo su afinidad por sus secuencias diana. Aunque una célula puede contener múltiples TCS, la transferencia entre sensores y reguladores asociados suele ser muy específica. Algunos RR pueden también ser fosforilados por metabolitos como el acetil-fosfato, que son indicadores del estado energético celular. PrcR es un RR de Lactobacillus casei que controla la expresión de un gran número de genes en este organismo, especialmente genes implicados en la captación de fuentes de nitrógeno (Alcántara et al. 2016; https://doi.org/10.1111/mmi.13299). En un estudio previo llevado a cabo en el laboratorio de Bacterias Lácticas y Probióticos se ha observado que PrcR puede ser fosforilado independientemente de su sensor asociado PrcK. Con el fin de determinar si PrcR es fosforilado por acetil-fosfato, se plantea la alteración de las rutas de síntesis de acetil-fosfato en este organismo con el objeto de determinar su efecto sobre el estado de fosforilación de PrcR. En Lb. casei los niveles de acetil-P están controlados por las actividades de piruvato oxidasas, fosfotransacetilasa, acetato quinasas y acilfosfatasa. Se dispone de datos transcriptómicos que permiten estimar la expresión de los genes implicados en las condiciones típicas de cultivo de este organismo. El trabajo propuesto planteó en primer lugar, a partir de los datos transcriptómicos, obtener cepas mutantes deficientes de acetato quinasa y fosfotransacetilasa por recombinación homóloga. Con este fin fueron usados vectores no replicativos siguiendo métodos habituales en el laboratorio. Los resultados de esta parte del trabajo indicaron que la obtención de mutantes deficientes en fosfotransacetilasa debían ser obtenido por otras técnicas de transformación genética. En segundo lugar, se determinó el estado de fosforilación de PrcR mediante análisis por electroforesis con el reactivo Phos-tag y detección mediante Western con un suero específico contra PrcR de extractos crudos obtenidos de bajo distintas condiciones de cultivo. Los resultados obtenidos mostraron una posible relación entre el acetil-fosfato con el estado de fosforilación de PrcR, aunque faltaría mas experimentación para poder confirmarlo.

[EN] Two-component signal transduction systems (TCS) are generally constituted by a protein sensor, normally anchored to the cell membrane, and a cytoplasmic response regulator (RR) that generally functions as a transcriptional regulator. The detection of a specific stimulus by the sensor activates its autophosphorylation and subsequent transfer of the phosphoryl group to the RR. The state of phosphorylation of the latter modulates its regulatory activity, increasing or reducing its affinity for its target sequences. Although a cell can have multiple TCS, the transfer between the sensors and the associated regulators are usually very specific. Some of them can also be phosphorylated by metabolites such as acetyl-phosphate, which are indicators of the cellular energy status. PrcR is a RR of Lactobacillus casei that contols the expression of a large number of genes in this organism, especially genes involved in the uptake of nitrogen sources (Alcántara et al., 2016; https://doi.org/10.1111/mmi. 13299). In a previous study carried out in the Laboratory of Lactic Acid Bacteria and Probiotics, it has been observed that PrcR can be phosphorylated independently of its associated sensor PrcK. In order to determine if PrcR is phosphorylated by acetyl-phosphate, it was decided to test the alteration of the routes of synthesis of acetyl-phosphate in this organism in order to determine its effect on the state of the phosphorylation of PrcR. In Lb. casei the levels of acetyl-P are controlled by the activities of pyruvate oxidases, phosphotransacetylase, acetate kinases and acyl phosphatase. Transcriptional data are available to estimate the expression of the genes involved in the typical culture conditions of this organism. The proposed work first raised, from the transcriptomic data, mutant deficient strains of acetate kinase and phosphotransacetylase by homologous recombination. To this end, non-replicative vectors were used following common laboratory methods, the results of this part of the work indicated that the phosphotransacetylase-deficient mutants should be obtained by other genetic transformation techniques. Secondly, the phosphorylation status of PrcR was determined by electrophoresis analysis with the Phos-tag reagent and Western detection with a specific serum against PrcR of crude extracts obtained under different culture conditions. The results obtained showed a possible relationship between acetyl-phosphate and the phosphorylation state of PrcR, although more experimentation would be necessary to confirm it.