Integración de diferentes fenómenos fotónicos en tecnología de disco compacto para el desarrollo de biosensores label-free

Abstract

[ES] En esta tesis se ha abordado el desarrollo de biosensores ópticos label-free, basados en tecnología de disco compacto, permitiendo así abaratar y simplificar su fabricación. El trabajo llevado a cabo ha consistido en estudiar diferentes propiedades físico-químicas desarrolladas por diversos materiales. Ello ha permitido obtener sistemas compactos y accesibles, capaces de sensar con buenas prestaciones analíticas en diferentes escenarios. En el capítulo 1 se presenta un estudio de inhibición enzimática sobre discos Blu-ray como plataforma de ensayo para el cribado de fármacos. Para ello, se inmoviliza orientadamente una glicoenzima, de la familia de las peroxidasas sobre la superficie del disco, cuya actividad se relaciona con los compuestos a cribar. Después de ensayar cada compuesto, se determina el grado de inhibición enzimática mediante la adición de un sustrato. La cantidad de producto obtenido, inversamente proporcional al potencial inhibitorio del compuesto en estudio, es cuantificado con un lector de discos que registra las variaciones en la intensidad del haz laser reflejado debidas al producto enzimático. Ello permite realizar más de 1700 ensayos simultáneos en un único disco Blu-ray lo que muestra su potencial en análisis masivo de alto rendimiento. Además, se plantea una estrategia basada en hipersuperficies para el análisis de la elevada cantidad de datos que se generan en las etapas del proceso de descubrimiento de fármacos. En el capítulo 2 se aborda el estudio de una metodología para reducir el ruido generado en la lectura de resultados obtenidos con biosensores ópticos, mejorando así su sensibilidad. Para ello, se plantea la estructuración del ensayo en forma de franjas en lugar del tradicional microarray, generando una señal periódica sinusoidal al ser escaneadas. Al analizar dicha señal en dominio de frecuencias, ésta se concentra en un pico a la frecuencia del ensayo, mientras que la mayor parte del ruido aparece a frecuencias mucho más altas. Inicialmente se quería reducir al máximo el ruido, para diferenciar las interacciones moleculares en formato label free. Sin embargo, los ensayos realizados con discos DVD no generaron suficiente señal, teniendo que recurrir en esta ocasión al marcaje para la cuantificación de inmunoglobulinas G y de caseína. Pese a ello, la metodología desarrollada también se puede aplicar en biosensores tipo label-free, reduciendo el ruido y mejorando su sensibilidad. El capítulo 3 se centra en el desarrollo de sustratos interferométricos multicapa que varían la intensidad de la luz reflejada al realizar un ensayo analítico en su superficie. Los sustratos fueron fabricados utilizando los materiales que componen los DVD-RW, depositados en capas de espesor controlado con el fin de obtener la máxima respuesta. A su vez, se diseñaron de tal forma que uno de ellos disminuya la intensidad del haz reflejado como respuesta a las interacciones moleculares, mientras que el otro la aumenta. El trabajo incluye la utilización de principios y materiales de la tecnología de disco compacto para el desarrollo del sistema de detección. Para ello, se emplea el cabezal de un lector de DVD, ya que dispone de un láser y de todos los elementos ópticos necesarios para el escaneado vertical. Con este sistema se cuantifican con éxito y sin marcaje inmunoglobulinas G y sulfasalazina, una macromolécula y un fármaco de masa molecular reducida. El capítulo 4 consiste en la fabricación de un cristal fotónico utilizando la estructura de los discos compactos cubiertos con una película de óxido de titanio. Se han estudiado las propiedades físico-químicas de estos sustratos y se han caracterizado sus propiedades fotónicas. Todo ello está en concordancia con los resultados obtenido mediante simulaciones. Para interrogar los cristales fotónicos fueron necesarios una fuente de luz blanca y un espectrofotómetro, además de los elementos ópticos necesarios

[CA] En aquesta tesi s'ha abordat el desenvolupament de biosensors òptics label-free, basats en tecnologia de disc compacte, permetent així abaratir i simplificar la seua fabricació. El treball dut a terme ha consistit en estudiar diferents propietats fisicoquímiques desenvolupades per diversos materials. Això ha permès obtenir sistemes compactes i accessibles, capaços de sensar, amb bones prestacions analítiques, en diferents escenaris. En el capítol 1 es presenta un estudi d'inhibició enzimàtica sobre discos Blu-ray com a plataforma d'assaig per al cribratge de fàrmacs. Per a això, s'immobilitza de manera orientada una glicoenzima de la família de les peroxidases sobre la superfície del disc, i la seua activitat es relaciona amb els compostos a garbellar. Després d'assajar cada compost, es determina el grau d'inhibició enzimàtica mitjançant l'addició d'un substrat. La quantitat de producte obtingut, inversament proporcional al potencial inhibitori del compost en estudi, és quantificat amb un lector de discos que registra les variacions en la intensitat del làser reflectit degudes al producte enzimàtic. Això permet realitzar més de 1700 assajos simultanis en un únic disc Blu-ray el que mostra el seu potencial en anàlisi massiva d'alt rendiment. A més, es planteja una estratègia basada en hipersuperficies per a l'anàlisi de l'elevada quantitat de dades que es generen en les etapes del procés de descobriment de fàrmacs. En el capítol 2 s'aborda l'estudi d'una metodologia per reduir el soroll generat en la lectura de resultats obtinguts amb biosensors òptics, millorant així la seua sensibilitat. Per a això, es planteja l'estructuració de l'assaig en forma de franges en lloc del tradicional microarray, generant un senyal periòdic sinusoïdal en ser escanejades. En analitzar aquest senyal en domini de freqüències, aquesta es concentra en un pic a la freqüència de l'assaig, mentre que la major part del soroll apareix a freqüències molt més altes. Inicialment es volia reduir al màxim el soroll, per diferenciar les interaccions moleculars en format label-free. No obstant això, els assajos realitzats amb discos DVD no van generar prou senyal, havent de recórrer en aquesta ocasió al marcatge per a la quantificació d'immunoglobulines G i de caseïna. Malgrat això, la metodologia desenvolupada també es pot aplicar en biosensors tipus label-free, reduint el soroll i millorant la seua sensibilitat. El capítol 3 es centra en el desenvolupament de substrats interferometrics multicapa que varien la intensitat de la llum reflectida en realitzar un assaig analític en la seua superfície. Els substrats van ser fabricats utilitzant els materials que componen els DVD-RW, dipositats en capes de gruix controlat per tal d'obtenir la màxima resposta. Al seu torn, es van dissenyar de tal manera que un d'ells disminueixi la intensitat del feix reflectit com a resposta a les interaccions moleculars, mentre que l'altre l'augmenta. El treball inclou la utilització de principis i materials de la tecnologia de disc compacte per al desenvolupament del sistema de detecció. Per a això, es va utilitzar el capçal d'un lector de DVD, ja que disposa d'un làser i de tots els elements òptics necessaris per a l'escanejat vertical. Amb aquest sistema es quantifiquen amb èxit i sense marcatge immunoglobulines G i sulfasalazina, un macromolècula i un fàrmac de massa molecular reduïda. El capítol 4 consisteix en la fabricació d'un cristall fotònic utilitzant l'estructura dels discos compactes coberts amb una pel·lícula d'òxid de titani. S'han estudiat les propietats fisicoquímiques d'aquests substrats i s'han caracteritzat les propietats fotòniques. Tot això està en concordança amb els resultats obtingut mitjançant simulacions. Per interrogar els cristalls fotònics van ser necessaris una font de llum blanca i un espectrofotòmetre, a més dels elements òptics necessaris per guiar la llum.

[EN] In this thesis the development of label-free optical biosensors, based on compact disc technology, has been approached, thus making their manufacture cheaper and simpler. The work carried out has consisted of studying different physical-chemical properties manifested with several materials. This has allowed to obtain compact and accessible systems, capable of sensing with a great analytical performance in different scenarios. Chapter 1 presents an enzymatic inhibition study on Blu-ray discs as a test platform for drug screening. For this purpose, a glycoenzyme of the peroxidase family is immobilized on the surface of the disc whose activity is related to the compounds to be screened. After testing each compound, the degree of enzymatic inhibition is determined by adding the enzymatic substrate. The amount of product obtained is inversely proportional to the inhibitory potential of the compound, and is quantified with a disk reader that records the variations in the intensity of the reflected laser beam due to the enzymatic product. In addition, more than 1700 tests are performed on a single Blu-ray disc as proof of concept for application in high performance analysis and a hypersurface based strategy is proposed for the analysis of the large amount of data generated in the stages of the drug discovery process. Chapter 2 deals with the study of a methodology to reduce noise generated in the reading of results obtained with optical biosensors, hence improving their sensitivity. For this purpose, the structure of the test is proposed in the form of stripes instead of the traditional microarray, generating a sinusoidal periodic signal when they are scanned. When analysing this signal in frequency domain, it is concentrated in a peak at the frequency of the test, while most of the noise appears at much higher frequencies. Initially, the aim was to reduce noise as much as possible in order to differentiate molecular interactions in a label-free format. However, the tests carried out on a DVD did not generate enough signal, having to resort to labelling on this occasion for the quantification of immunoglobulins G and casein. Nevertheless, the methodology developed can be applied to label-free biosensors, reducing noise and improving sensitivity. Chapter 3 focuses on the development of multilayer interferometric substrates that vary the intensity of reflected light when performing an analytical test on their surface. The substrates were manufactured using the materials that make up the DVD-RW, deposited in layers of controlled thickness in order to obtain maximum response. At the same time, they were designed in such a way that one of them decreased the intensity of the reflected beam as a response to molecular interactions, while the other increased it. The work includes the use of principles and materials from compact disc technology for the development of the detection system. For this, the head of a DVD reader is used, as it has a laser and all the optical elements necessary for vertical scanning. With this system, immunoglobulins G and sulfasalazine, a macromolecule and a drug with reduced molecular mass are successfully quantified without labelling. Chapter 4 consists of the fabrication of a photonic crystal using the structure of the compact discs covered with a titanium oxide layer. The physical-chemical properties of these substrates have been studied and their photonic properties have been characterized. All this is in accordance with the results obtained through simulations. To interrogate the photonic crystals, a white light source and a spectrophotometer were needed, as well as the optical elements necessary to guide the light.