Nuevas aplicaciones de la monitorización en tiempo real de la expresión génica en levadura: Respuesta a ácidos orgánicos y regulación del ciclo celular

Abstract

[ES] La levadura es un modelo celular para comprender los mecanismos moleculares que emplean las células eucariotas para adaptarse a estreses químicos. Un importante mecanismo de señalización es el reconocimiento directo del compuesto químico por factores de transcripción que lleva a la activación de la expresión génica de diversos transportadores del tipo multidroga. En levadura existe una familia de activadores transcripcionales del tipo zinc-cluster que se dedican al reconocimiento de diferentes compuestos xenobióticos. Ácidos orgánicos como el ácido acético, sórbico o benzoico activan el sistema multidroga en levadura. En este proyecto queremos cuantificar de forma dosis-dependiente la respuesta a los tres ácidos con reporteros de luciferasa desestabilizada. Además, se investigará la función de factores de transcripción particulares (como Pdr1, Pdr3 y otros) en este proceso. El empleo de mutantes para estos activadores en ensayos de supervivencia nos indicará la función fisiológica de cada factor. Por otra parte, se pretende crear nuevas herramientas basadas en luciferasas desestabilizadas para la monitorización del ciclo celular durante las respuestas a estrés. Durante la adaptación a estrés químico se para transitoriamente el ciclo celular hasta la efectiva adaptación. Por lo tanto, la cuantificación de las células que reanudan el ciclo celular después de un insulto químico nos puede proporcionar una manera de cuantificar la eficiencia de su adaptación. Se fusionarán varios promotores naturales regulados por el ciclo celular, por ejemplo, CLN1, o regulados específicamente en células hijas, por ejemplo, DSE2, con el gen de luciferasa. Se comprobarán estas construcciones plasmídicas en levadura durante la adaptación a diferentes tipos y grados de estrés.

[EN] Yeast is a cellular model to understand the molecular mechanism of the adaptation of eukaryotic cells to chemical stresses. An important signalling mechanism is the direct recognition of the chemical compound by transcriptional factors that leads to the activation of the gene expressions of various multidrugs transporters. In yeast there is a family of transcriptional activator of the zinc-cluster type that are engaged in the recognition of different xenobiotic compounds. Organic acids such as acetic, sorbic or benzoic acid activate the multidrug system in yeast. In this project we want to quantify in a dose-dependent manner the response to the three acids with reporters of destabilized luciferase. In addition, the function of particular transcription factors (such as, Pdr1, Pdr3, and others) will be investigated in this process. The use of mutants for these activators in survival trials will indicate the physiological function of each factor. On the other hand, we intend to create new tools based on destabilized luciferases for the monitorization of the cell cycle upon stress exposure. During the adaptation to chemical stress, the cell cycle is temporarily stopped until the effective adaptation. Therefore, the quantification of cells that resume the cell cycle after a chemical insult can provide us with a way to quantify the efficiency of their adaptation. Several natural promoters regulated by the cell cycle, for example, CLN1, or specifically regulated in daughter cells, for example, DSE2, will be fused with the luciferase gene. These plasmid constructions will be functionally tested in yeast during the adaptation to different types and degrees of stress.