Detección de nuevas virosis en cultivos hortícolas de la Comunidad Valenciana mediante técnicas moleculares

Abstract

[ES] Las enfermedades emergentes causadas por virus son el origen de importantes pérdidas económicas en cultivos de todo el mundo. Es por tanto necesario disponer de métodos de diagnóstico específicos y sensibles que permitan identificar dichos virus para aplicar las estrategias de control adecuadas. La secuenciación masiva de RNAs pequeños (Small RNA deepsequencing, SRDS) procedentes de la degradación de moléculas virales mediante el mecanismo de silenciamiento génico de la propia planta, es una técnica que permite identificar potenciales patógenos de los que no se disponga de secuencias genéticas. Mediante esta técnica se han identificado varios virus que infectan el cultivo de boniato (Ipomoea batata) y un virus nuevo en chufa (Cyperus esculentus). En este trabajo se han desarrollado métodos de detección para virus que afectan a boniato y a chufa, mediante SRDS. En el caso del boniato, se diseñaron cebadores específicos de secuencia y se empleó PCR convencional para la detección de Sweet potato badnavirus A (SPBVa), Sweet potato badnavirus B (SPBVb), Sweet potato badnavirus C (SPBVc) y Sweet potato leaf curl virus (SPLCV) en las variedades Covington, California, Blanco y Beauregard. También se observó que, tras el cultivo in vitro de meristemos de plantas de boniato, se consiguió la erradicación de SPBVa, SPBVc y SPLCV en las 15 muestras analizadas, y sólo una de las plantas de la variedad California de las 15, dio un resultado positivo en el análisis del SPBVb. Por ello, concluímos que se trata de una técnica eficaz para la obtención de material vegetal libre de virus. Por otro lado, en el IVIA se ha secuenciado un nuevo virus que afecta al cultivo de la chufa. Por ello, en este trabajo se han puesto a punto las técnicas de RT-PCR, la RT-qPCR mediante uso de sondas TaqMan y con SYBRGreen, y la RT-LAMP. La RT-qPCR mostró una sensibilidad 10 veces superior que la RT-PCR convencional y la RT-LAMP, siendo 10-4 ng/µl de extracto de RNA total, la mínima concentración detectada. El estudio de especificidad mostró que no hubo amplificación en ninguno de los testigos negativos. Además, se ha podido llevar a cabo la detección del virus con extractos brutos directos mediante todas las técnicas empleadas, pudiendo así evitar el proceso de extracción de ácidos nucleicos. Esto permite reducir el tiempo y el costo del ensayo.

[EN] Emerging diseases caused by virus are the source of significant economic losses in crops around the world. It is therefore essential the development of specific and sensitive diagnostic methodology that enable the identification of these viruses to apply the appropriate control strategies. Massive sequencing of sRNA produced during the molecular degradation of virus gene silencing defense mechanism of the plant, is a technique used to identify potential pathogens of which genetic sequences are not available. This technique can play an important role in the identification of viruses in sweet potato (Ipomoea batatas) crop and tiger nut (Cyperus esculentus). In this project, several detection methods have been developed for both, sweet potato and tiger nut viruses found through technique described above. In the case of sweet potato, specific sequence primers were designed and conventional PCR was used for the detection of Sweet potato badnavirus A (SPBVa), Sweet potato badnavirus B (SPBVb), Sweet potato badnavirus C (SPBVc) and Sweet potato leaf curl virus (SPLCV) in the varieties Covington, California, Blanco and Beauregard. It was also observed that, after the in vitro culture of sweet potato plants meristems, viral eradication was achieved in 15 samples analized in the case of SPBVa, SPBVc and SPLCV. Only one of the plants of the California variety tested positive for SPBVb. Therefore, we conclude that it is an effective technique for obtaining free of virus plant material. On the other hand, in the IVIA (Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias) has been sequenced a new virus that affects the cultivation of tiger nut. Therefore, in this project RT-PCR, RT-qPCR by using TaqMan probes and with SybrGreen and RT-LAMP techniques have been developed. The RT-qPCR showed a sensitivity 10 times higher than the conventional RT-PCR and the RT-LAMP, being 10-4 ng/µl of total RNA minimum concentration detected. The specificity study showed no amplification in any of the negative controls. In addition, it has been possible to carry out virus detection using crude extracts using all the techniques described, thus avoiding the nucleic acid extraction. This allows to reduce the time and the cost of the test.