Desarrollo de un modelo de inmunoensayo heterogéneo utilizando soportes de fibra de vidrio con hidrofobicidad modulada mediante silanización

Abstract

[ES] En el presente trabajo se propone el empleo de fibras de vidrio como un soporte sólido para reacciones de reconocimiento molecular, en especial interacciones proteínaproteína. Para el presente trabajo se toma como base los estudios previos realizados en el grupo de investigación con la interacción biotina-estreptavidina y se adaptará a un inmunoensayo heterogéneo indirecto típico. Inicialmente, se modificará la hidrofobicidad de superficies de microfibra empleando diversos alquenilsilanos con diversa longitud de cadena, bien sea individualmente o mezclados con un fluoroalquenilsilano a diferentes porcentajes. A continuación, se fijarán a la superficie matrices de gotas de una biotina tiolada mediante la reacción fotoquímica del tiol-eno. Posteriormente se hará reaccionar un anticuerpo policlonal antibiotina de conejo con la biotina tiolada fijada a las superficies por la reacción tiol-eno y, finalmente, se aplicará un anticuerpo secundario anticonejo marcado con Alexa-fluor 647. La imagen de los puntos de fluorescencia obtenidos será apropiadamente tratada para obtener la intensidad, tamaño y SNR (señal sobre ruido) de los mismos. Los resultados nos permitirán estudiar cómo la hidrofobicidad afecta a las señales obtenidas en las diferentes superficies, aumentando la calidad de los puntos según las superficies se vuelven más hidrofóbicas, debido bien al uso de un silano más hidrofóbico (cadena más larga) o bien a la adición del fluoroalquenilsilano. Los valores del ángulo de contacto (WCA), la intensidad de la señal y su SNR nos permitirán comparar diferentes tratamientos y comprobar su viabilidad en procesos de reconocimiento molecular. Los resultados permitirán estudiar cómo la hidrofobicidad afecta a las señales conseguidas en las diferentes superficies examinadas, mostrando cómo estas pueden ser usadas en aplicaciones biológicas.

[EN] In this project, the use of glass-fibre based supports is proposed as a solid basement for molecular recognition reactions, specifically, protein-protein interactions. The conducted research is based on previous studies performed by the research group with biotin-streptavidin interactions and were adapted to an indirect heterogenic immunoassay. To begin with, the hydrophobicity of the glass-fibre supports was modified using different alkenylsilanes with different chain lengths, either individually or mixed with a fluoroalkenylsilane at different percentages. Then, at the surface of the supports, arrays of a thiol-biotin derivative were anchored by means of the photochemical click thiol-ene reaction on the surfaces. Following, a polyclonal antibiotin antibody (from rabbit) was spread throughout the surface to bind the previously anchored biotin. Finally, a secondary antibody (antirabbit) tagged with Alexa-fluor 647 was applied. The resulting image of fluorescence was properly treated and analysed on parametters such as intensity, size and SNR (signal to noise ratio). Results allow the study of the effect of hydrophobicity on the obtained signals, increasing the quality of the spots observed on the surfaces as they became more hydrophobic. Whether caused by the use of a long chain silane (more hydrophobic) or because of the addition of the fluoroalkenylsilane. The values of the water contact angles (WCA), the intensity of the signal, and their SNR, enable the comparison between different treatments and the study of their viability as molecular recognition processes. Results allow the comparison of different surface treatments and show their feasibility in biomolecular recognition events.

[CA] En el present treball es proposa l'ús de fibres de vidre com un suport sòlid per a reaccions de reconeixement molecular, especialment interaccions proteïna-proteïna. Per al present treball es prenen com a base els estudis previs realitzats en el grup d'investigació amb la interacció biotina-estreptavidina i s'adaptarà a un immunoassaig heterogeni indirecte típic. Inicialment, es modificarà la hidrofobicitat de superfícies de microfibra emprant diversos alquenilsilans amb diversa longitud de cadena, bé siga individualment o barrejats amb un fluoroalquenilsilà a diferents percentatges. A continuació, es fixaran a la superfície matrius de gotes d'una biotina tiolada mitjançant la reacció fotoquímica del tiolalqué. Posteriorment es farà reaccionar un anticòs policlonal antibiotina de conill amb la biotina tiolada fixada a les superfícies per la reacció tiol-alqué i, finalment, s'aplicarà un anticòs secundari anticonill marcat amb Alexa-*fluor 647. La imatge dels punts de fluorescència obtinguts serà apropiadament tractada per a obtindre la intensitat, grandària i SNR (senyal sobre soroll) d'aquests. Els resultats ens permetran estudiar com la hidrofobicitat afecta a les senyals obtingudes en les diferents superfícies, augmentant la qualitat dels punts segons les superfícies es tornen més hidrofòbiques, degut bé a l'ús d'un silà més hidrofòbic (cadena més llarga) o bé a l'addició del fluoroalquenilsilà. Els valors de l'angle de contacte (WCA), la intensitat del senyal i el seu SNR ens permetran comparar diferents tractaments i comprovar la seua viabilitat en processos de reconeixement molecular. Els resultats permetran estudiar com la hidrofobicitat afecta als senyals aconseguits en les diferents superfícies examinades, mostrant com aquestes poden ser usades en aplicacions biològiques.