Biosensado en formato de micromatriz para la detección de MICRO-RNA

Abstract

[ES] La detección temprana de numerosas enfermedades, principalmente el cáncer, exige desarrollar nuevos métodos de diagnóstico con bases moleculares. En este contexto, la detección de microRNAs es importante debido a su papel en la proliferación celular y la apoptosis, procesos cuya desregulación se relaciona directamente con la aparición de alteraciones fisiológicas. Además, estos biomarcadores se pueden aislar a partir de muestras de pacientes de un modo mínimamente invasivo. Este estudio presenta el desarrollo de tres métodos de detección de microRNAs basados en la hibridación en formato de micromatriz y sensado óptico. Las variables estudiadas son el material y la concentración de reactivos empleados durante la derivatización, logrando la unión covalente de las sondas. Para caracterizar las superficies modificadas, se estimó su hidrofobicidad a partir de medidas del ángulo de contacto de gotas de agua. La inmovilización de sondas tioladas resultó efectiva en el caso del vidrio funcionalizado con un organosilano poseedor de un grupo vinilo (-C=C) terminal, permitiendo que tuviese lugar la reacción fotoquímica del tiol-eno entre la superficie y las sondas. El anclaje de sondas aminadas se logró al emplear chips de policarbonato funcionalizado tanto con grupos isocianato (-N=C=O) como con grupos carboxilato (-COOH). Los tres métodos se ensayaron para la hibridación de microRNAs sintéticos (miR-21, miR-191 y miR-155) y ésta se detectó colorimétricamente. Finalmente, se estudiaron las prestaciones de cada uno de los sistemas de biosensado con el objetivo de estimar su posible aplicación clínica.

[EN] The early detection of numerous diseases such as cancer requires the development of new diagnostic methods with molecular basis. In this context, microRNAs detection is important due to their function in cellular proliferation and apoptosis, processes whose deregulation is directly related to the apparition of physiological alterations. Moreover, these biomarkers can be isolated from patient samples in a non-invasive way. This study reports the development of three microRNA detection methods based on hybridization in microarray format and optical sensing. The variables studied are the material and the reagents concentrations used during derivatization, reaching the covalent immobilization of the probe. For characterizing modified surfaces, hydrophobicity was estimated through water contact angle measurements. Thiolated probe immobilization was effective in the case of functionalized glass with an organosilane containing a terminal vinyl group (-C=C) because of the thiol-ene reaction between surface and probes. Amine probe immobilization was achieved when using functionalized polycarbonate chips with isocyanate groups (-C=N=O) or with carboxylated groups (-COOH). These three biosensing systems were analysed for the hybridization of synthetic microRNAs (miR-21, miR-191 and miR-155), and it was estimated colorimetrically. Finally, capacities for each method were studied with the aim of estimate their clinical application.