Estudio de un método de fotoinmovilización, con características de química-click, para el anclaje efectivo y orientado de anticuerpos sobre soportes sólidos con fines de biosensado

Abstract

[ES] Disponer de herramientas de análisis rápidas, sensibles y específicas es una de las demandas de la sociedad actual. Estas herramientas encuentran aplicación no sólo en el campo clínico, sino también en el control de calidad, agroalimentación o control medioambiental, entre otros. Una estrategia muy utilizada para reconocer específicamente el analito es hacer uso de bioreceptores tales como anticuerpos o ácidos nucleicos. Estos ensayos pueden trabajar tanto en formato homogéneo como en heterogéneo. En los ensayos en formato heterogéneo los analitos son reconocidos por elementos de captura específicos que están inmovilizados en un soporte sólido. Los soportes pueden actuar como transductor o como soporte inerte. De entre todos los tipos de inmovilización de moléculas, la covalente es la más interesante debido a su robustez. En este trabajo final de grado se plantea la puesta a punto de un nuevo método de anclaje para anticuerpos basado en un tipo de reacciones conocidas como química-click. Para poder realizar este anclaje es necesaria la presencia de enlaces C-F en la superficie sólida. Este tipo de compuestos repelen muy bien la adsorción inespecífica de proteínas y materia orgánica y permiten la unión covalente de los anticuerpos a través de sus tioles libres mediante una reacción fotoinducida de sustitución nucleofílica de los F. Se intentará mejorar y optimizar las condiciones con respecto a las técnicas de anclaje estudiadas, para el uso en biosensado. Para poder llevar a cabo esta reacción de inmovilización, los anticuerpos necesitan tener grupos tioles libres, por eso se van a reducir anticuerpos de forma selectiva empleando diferentes agentes reductores hasta encontrar el que trabaje de forma óptima. De este modo los tioles que normalmente están formando puentes disulfuro quedarán libres e interaccionarán con la superficie funcionalizada. Para la funcionalización del soporte sólido se han empleado técnicas de derivatización química con organosilanos. En el trabajo se optimizan las condiciones usando albúmina de suero bovino y su anticuerpo como sistema modelo y posteriormente se aplica a una proteína de interés terapéutico como es la proteína C-reactiva. En este trabajo se ha elegido el formato de micromatriz con marcaje fluorescente ya que tiene una alta capacidad de trabajo y multiplexado.

[EN] Having fast, sensitive and specific analysis tools is one of the demands of today’s society. These tools find application not only in the clinical field, but also in quality control, and agrifood or environmental control, among others. A widely used strategy to specifically recognize the analyte is to make use of bioreceptors such as antibodies or nucleic acids. These tests can work in both homogeneous and heterogeneous formats. In assays in heterogeneous format, analytes are recognized by specific capture elements that are immobilized on a solid support. The supports can act as a transducer or as an inert support. Among all types of immobilization methods of molecules, the covalent is the most interesting due to its robustness. In this Bachelor’s thesis, the development of a new anchoring method for antibodies based on a type of reactions known as chemical-click is proposed. In order to perform this anchoring, the presence of C-F bonds on the solid surface is necessary. This type of compounds very well repels the non-specific adsorption of proteins and organic matter and allow the covalent binding of the antibodies through their free thiols through a photoinduced reaction of nucleophilic substitution of the F. We will try to improve and to optimize the conditions comparing with the anchoring techniques studied so far, for use in biosensing. In order to carry out this immobilization reaction, the antibodies need to have free thiol groups, that is why antibodies will be selectively reduced using different reducing agents until finding the one that works optimally. In this way the thiols that are normally forming disulfide bounds will be free and will interact with the functionalized surface. For the functionalization of the solid support, organosilane chemistry techniques have been used. In this work, conditions are optimized by using bovine serum albumin and its antibody as a model system and subsequently applied to a protein of therapeutic interest such as C-reactive protein. We choose the microarray format with fluorescent marking since it has a high working capacity and multiplexing.