Optimización de la técnica de PCR digital para la detección de mutaciones en el ADN circulante a partir de biopsias líquidas de pacientes con tumores sólidos

Abstract

[ES] El cáncer es considerado el rompecabezas de la medicina actual, pues además de su elevada incidencia y mortalidad, el mayor obstáculo por superar se trata del adecuado plan de diagnóstico y tratamiento personalizado a seguir. Actualmente, este seguimiento se basa sobre todo en pruebas de imagen o exploraciones quirúrgicas. No obstante, estos métodos no proporcionan una información clara sobre su perfil molecular, dificultando el objetivo descrito. Un reducido número de técnicas sugieren la idea de detectar mutaciones características de tipo tumoral mediante extracción y análisis de ADN libre circulante (cfDNA). En el proceso de colonización, muchos tumores primarios, lesiones metastásicas y células tumorales circulantes (CTC), pueden liberar ADN circulante tumoral (ctDNA) a los fluidos corporales. Así ha surgido el nuevo concepto de biopsia líquida, que se corresponde con todo aquel fluido corporal (plasma sanguíneo, saliva, orina, líquido pleural…) susceptible de detección de alelos mutantes. Estas biopsias presentan grandes ventajas frente a las convencionales conservadas en parafina, como su obtención mediante procedimientos mínimamente invasivos o su reducido coste de operación. En el momento en que el análisis personalizado de mutaciones pueda desarrollarse mediante una mera extracción de saliva u orina, podría dar comienzo una revolución en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de enfermedades oncológicas, beneficiándose tanto pacientes en estadios iniciales como avanzados. La revolucionaria plataforma de PCR digital o droplet digital PCR (ddPCR) permite analizar y detectar el ctDNA con alta precisión. Esto se puede lograr mediante la fragmentación de la muestra en un conjunto de nanogotas, cada una representando una molécula individual en una emulsión de aceite. Se ha demostrado que este procedimiento permite alcanzar una sensibilidad de detección menor al 0,01% en sangre, por lo que ha sido bautizada como la 3ª generación de PCR. En el presente TFG, en primer lugar se ha optado por ensayar diferentes kits de extracción de cfDNA en diferentes tipos de biopsias líquidas (plasma, orina y saliva) y biopsias de tumor insertadas en parafina, con objeto de establecer el kit garantizador de una mayor eficiencia de extracción. Se partieron de pacientes con cáncer de cabeza y cuello (HNC) y vejiga (BLC). Posteriormente, este material fue testado en diferentes ensayos de ddPCR, con el fin último de optimizar qué protocolo seguir para obtener los mejores resultados posibles en cada uno de los casos. También se diseñaron estrategias de resolución de problemas comunes encontrados en el camino, como la preamplificación del material de partida o la digestión enzimática con el fin de reducir el efecto lluvia característico en biopsias de tumor. Se pudo determinar la cantidad óptima a añadir en muestras de biopsia de orina en un rango de 20-50 ng. No obstante, el dato más esclarecedor fue hallar altos porcentajes de mutación en 3 de los 12 pacientes de BLC: PIK3CA E545K en un 42%, y FGFR3 S249C en un 38,7% y un 31,8%. Esto supuso un claro paso a favor hacia la búsqueda de una medicina de precisión lo más especializada posible en pacientes oncológicos mediante el uso de biopsias líquidas.

[EN] Cancer is considered as the jigsaw puzzle of current medicine since in addition to the high number of cases and mortality, the largest obstacle to overcome is the appropriate diagnosis and personalized treatment plan to follow. Nowadays, this monitoring is based mainly on image tests and surgical explorations. However, these methods do not supply clear information on their molecular profile, hindering the described objective. A reduced number of techniques suggest the idea of detecting characteristic tumoral mutations through the extraction and analysis of the circulating free DNA (cfDNA). In the process of colonization, many primary tumors, metastatic lesions, and circulating tumor cells (CTC), can release circulating tumor DNA (ctDNA) to body fluids. In this context, the concept of liquid biopsy has emerged, which corresponds to every circulating body fluid (blood plasma, saliva, urine, pleural fluid…) which is susceptible due to the detection of mutated alleles. These biopsies present a series of advantages over conventional ones preserved in paraffin, like its obtention through a minimally invasive process or its reduced cost of operation. When the personalized analysis of mutations can be developed from a simple saliva or urine extraction, it could initiate a revolution in the diagnosis, prognostic, and treatment of oncological diseases, being beneficial for both patients in initial and advanced stages. The revolutionary digital PCR platform or digital droplet PCR (ddPCR) allows the analysis and detection of the ctDNA with a high precision. This can be achieved by fragmenting the sample into a set of droplets, each representing an individual molecule in an oil emulsion. It has been demonstrated that this procedure enables reaching a detection sensitivity lower than 0,01% in blood, thus, being called the 3rd generation of PCR. In the present TFG, it was chosen, firstly, to try different cfDNA extraction kits using different types of liquid biopsies (plasma, urine and saliva), and tumor biopsies embedded in paraffin, with the objective of establishing which kit could guarantee a greater extraction efficiency. Patients with head and neck cancer (HNC), and bladder cancer (BLC) were the starting point. Subsequently, this material was tested in different ddPCR tests, with the ultimate goal being optimizing the protocol to be followed to obtain the best possible results in each case. New strategies were also designed so as to solve the problems encountered along the way, such as the pre-amplification of the starting material or the enzymatic digestion in order to reduce the characteristic rain effect of tumor biopsies. It was determined that the optimal amount to be added ranged from 20-50 ng in urine biopsy samples. However, the most enlightening information was finding high mutation percentages in 3 out of 12 initial BLC patients: PIK3CA E545K being 42%, and FGFR3 S249C being 38,7% and 31,8%. This represents a clear breakthrough towards the search for the most specialized precision medicine possible in cancer patients by means of the use of liquid biopsies.