Caracterización de los factores de transcripción que regulan la expresión de AHA2 en Arabidopsis thaliana

Abstract

[ES] QQS es un gen huérfano que tiene un papel relevante en el metabolismo del almidón incrementando el ratio nitrógeno/carbono, un rasgo agronómicamente muy interesante que se puede conseguir sobreexpresando QQS en arroz, soja y maíz (Li et al., 2009 y 2015). Además, QQS está relacionado con la protón ATPasa de la membrana plasmática (en Arabidopsis, AHA) responsable del crecimiento celular y la toma de nutrientes. Micromatrices de pérdida de función de las dos principales isoformas, aha1-6 y aha2-4, muestran niveles bajos de mRNA de QQS (Haruta et al., 2012). Este mismo fenómeno ocurre cuando se le añade al medio externo ácido acético a pH 5.5. Al mismo pH, la planta transgénica promQQS::QQS-GFP muestra una expresión baja, mientras que al subir el pH del medio a 7,5 la proteína QQS-GFP se induce. Una posterior publicación asigna a QQS la tarea de acompañar al interior del núcleo el factor de transcripción NF-YC4. Este pertenece a la familia NF-YCs, que se comporta como inhibidores transcripcionales de la bomba de protones. Posteriormente, analizando las secuencias de zonas promotoras de los AHAs se pone de manifiesto que AHA2 tiene 5 cajas CCAAT típicas de los NF-Ys, mientras que AHA1 tiene solo un par de ellas. El análisis de expresión mediante QRT-PCR de líneas de ganancia de función de QQS y NF-YC4 (NF-YC4 OE) muestran inhibición específica de la expresión del gen AHA2. En las mismas condiciones, la pérdida de función de QQS y el triple mutante nf-yc3,4,9 tienen aumentadas su expresión. El Western blot de la línea promQQS::QQS-GFP con anticuerpo contra GFP revela que QQS sube de expresión a lo largo del periodo de luz, y con la oscuridad desaparece. Las mismas muestras con anticuerpo contra las principales isoformas de AHAs muestran que ellas tienen una expresión constante y solo al final de la noche hay un pico de expresión. En pgm1 (enzima del cloroplasto que sintetiza glucosa-6-fosfato) tanto QQS como los AHAs a lo largo del día tienen una expresión que difiere de la de los controles. Otro mutante que afecta a los niveles de la glucosa-6-fosfato es hxk/gin2, con el cual se realiza un tratamiento con sacarosa tras pasar por una fase de ayuno, observándose que este azúcar induce la expresión de AHA2, aunque inhibe en los mutantes NF-YC4 OE y hxk1. En este caso pgm1 no parece ser limitante. Al analizar el promotor de AHA2, se observa una caja similar a la del gen FLC (FLOWERING LOCUS C). El factor de activación clave de ese gen se llama ptm, que procede de la pared del cloroplasto y reconoce una región de 63 pares de bases. El análisis de expresión del mutante ptm muestra una expresión reducida de AHA2, mientras que en líneas constitutivas con una versión truncada muestran sobreexpresión de la misma. Todo esto, nos ha llevado a comprobar si ptm reconoce la caja del promotor AHA2 mediante un ensayo de One Hybrid en levadura.

[EN] QQS is a gene that has a relevant role in the starch metabolism by increasing the nitrogen / carbon ratio, an agronomically interesting feature that can be reached by overexpressing QQS in rice, soybeans and corn (Li et al., 2009, Li et al., 2015) . In addition, QQS is related to the proton ATPase of the plasma membrane (in Arabidopsis, AHA), responsible for cell growth and nutrient intake. Microarrays of loss of function of the two main isoforms of AHA, aha1-6 and aha2-4, show low levels of QQS mRNA (Haruta et al., 2012). A subsequent publication assigns to QQS the task of facilitating the entry into the core of the transcription factor NF-YC4. This is a member of the NF-YCs family, which behave as transcriptional inhibitors of the proton pump. Subsequently, analyzing the sequences of the AHAs promoters, it is revealed that AHA2 has 5 CCAAT boxes typical of the NF-Ys, while AHA1 has only a couple of them. qRT-PCR expression analysis of QQS and NF-YC4 function gain lines (NF-YC4 OE) indicates specific inhibition of AHA2 gene expression. Under the same conditions, the loss of the QQS function and the triple mutant nf-yc3,4,9 have increased expression. The activation factor of that gene is called PTM, which is derived from the reduction of chloroplast and a region of 63 base pairs is recognized. The analysis of the expression of the mutant ptm2 (At5g22760), a gene of the family of the already described PTM, shows a reduced expression of AHA2, while in the constitutive lines with a truncated version show the overexpression of AHA2. Because of that, we are checking if PTM2 recognizes the AHA2 promoter box by means of a One Hybrid test in yeast.