Caracterización de supresores del silenciamiento génico del virus C de la leprosis de los cítricos

Abstract

[ES] El virus de la leprosis de los cítricos C (citrus leprosis virus C, CiLV-C) perteneciente al género Cilevirus, familia Kitaviridae, se considera el virus más devastador que infecta los cítricos en América del Sur, siendo uno de los principales patógenos virales responsables de la leprosis de los cítricos, una enfermedad grave que afecta los huertos de cítricos en América Latina. En este estudio, se ha analizado la capacidad de las proteínas codificadas por el RNA 1 (p29) y 2 (p15, p61, MP y p24) de CiLV-C de suprimir el silenciamiento génico (RNA silencing suppression, RSS) mediante el uso de cinco métodos. Usando el ensayo de agroinfiltración basado en la expresión transitoria de la proteína de fluorescencia verde (green fluorescent protein, GFP) en plantas de Nicotiana benthamiana que expresan constitutivamente la GFP (plantas 16c), no hemos encontrado potencial actividad supresora local o sistémica para las cinco proteínas codificadas por CiLV-C. Sin embargo, en el análisis de la acumulación de pequeños RNAs de interferencia (siRNA), observamos que la expresión ectópica de p29, p15 y p61 redujo significativamente la acumulación de siRNAs derivados del gen de la GFP. Cuando se evaluó la actividad RSS mediante el ensayo basado en el virus del mosaico de la alfalfa (alfalfa mosaic virus, AMV), encontramos que las proteínas p29, p15 y p61 de CiLV-C desencadenaron una respuesta necrótica y aumentaron la acumulación del RNA 3 de AMV, siendo ambos procesos indicativos de la capacidad supresora de las tres proteínas. La utilización del sistema basado en el virus del arrugamiento del nabo (turnip crinkle virus, TCV), en donde la expresión en trans de una proteína con actividad RSS permite complementar el transporte viral de un mutante deficiente de TSV, permitió identificar la capacidad supresora de la proteína p15. Finalmente, usando el sistema del virus X de la patata (potato virus X, PVX), la expresión de la p29 y p15 aumentó la patogenicidad de PVX, induciendo la muerte de las plantas de Nicotiana benthamiana infectadas. Además, la infección derivada de la construcción de PVX que expresaba la proteína p61 generó una respuesta hipersensible (hypersensitive response, HR), indicando que esta proteína también podría activar un mecanismo de defensa de la planta. En conjunto estos datos, demuestran que el genoma de CiLV-C codifica tres supresores del silenciamiento génico, siendo la primera vez que se describe la actividad RSS para proteínas de CiLV-C.

[EN] Citrus leprosis virus C (CiLV-C) belonging to the genus Cilevirus, family Kitaviridae, it is considered the most devastating virus infecting citrus in south American, being one of the main viral pathogens responsible for citrus leprosis (CL), a severe disease that affects citrus orchards in Latin America. In this study, proteins encoded by CiLV-C genomic RNA 1 and 2 were screened for potential RNA silencing suppression (RSS) activity by using of five methods. Using the green fluorescent protein (GFP)-based reporter agroinfiltration assay, we have no found potential local or systemic suppressor activity for the five CiLV-C encoded proteins. However, the analysis of small interfering RNAs (siRNAs) accumulation, revealed that the ectopic expression of the p29, p15 and p61 reduced significantly the accumulation of GFP derived siRNAs. When the RSS activity was evaluated using the alfalfa mosaic virus (AMV) system, we found that the p29, p15 and p61 CiLV-C proteins triggered necrosis response and increased the AMV RNA 3 accumulation, being both processes indicatives of a suppressive functionality. The use of the turnip crinkle virus (TCV) system, in which the cell-to-cell transport of a movement defective TCV mutant is restored when a RSS is trans-expressed, revealed RSS activity only for the p15 protein. Finally, using the potato virus X (PVX) system, the p29 and p15 expression enhanced the PVX pathogenicity, resulting in the death of the infected Nicotiana benthamiana plants. Furthermore, the infection derived from the PVX construct that express p61 (PVX-p61) induced a hypersensitive response (HR), suggesting that p61 also could activate a plant defense response mechanism. Collectively, these data demonstrate that the genome of CiLV-C encodes three suppressors of RNA silencing. This is the first report describing the RSS activity of CiLV-C proteins.