Desarrollo de vectores virales basados en el virus del mosaico de la alfalfa y/o el virus del moteado del melocotonero para el silenciamiento de genes de interés en planta

Abstract

[ES] El silenciamiento génico o conjunto de mecanismos que impiden que un gen específico se transcriba, representa una herramienta muy útil que puede ser aplicada en diferentes áreas de biotecnología de plantas, biología celular, etc. El silenciamiento de genes actúa a dos niveles: silenciamiento génico transcripcional (Transcriptional Gene Silencing o TGS) y silenciamiento génico post-transcripcional (Post-Transcriptional Gene Silencing o PTGS). Los mecanismos de TGS incluyen modificaciones epigenéticas de regiones promotoras o alteraciones de la cromatina, que permiten el bloqueo de la transcripción de un determinado gen. En el caso del silenciamiento PTGS, los mecanismos actúan directamente sobre el RNA mensajero, induciendo su degradación o el bloqueo de su traducción, utilizando para ello moléculas de RNA de pequeño tamaño (de 20 a 25 residuos de nucleótidos) denominadas RNA de interferencia o RNAi. Gracias a estos mecanismos las células modulan la expresión génica de su propio ADN y además intentan evitar la expresión de genes que no son propios (genes de parásitos intracelulares como virus, bacterias y otros eucariotas). Existen diferentes formas de inducir el silenciamiento de un determinado gen incluyendo la sobreexpresión del gen diana, la expresión de regiones del gen como RNA de doble cadena o la utilización de secuencias reguladoras basadas en microRNAs (miRNA), dirigidas al gen de interés, entre otras. Sin embargo, estos métodos dependen de la transformación y regeneración mediada por Agrobacterium, en donde la eficacia de la transformación y las tasas de éxito de la regeneración son factores limitantes, observándose especies vegetales que no se han podido transformar o donde el proceso global puede requerir hasta varios años. Una alternativa al silenciamiento génico mediado por transformación por Agrobacterium, lo representa el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS). Los virus de plantas presentan intermediarios de replicación de doble cadena de RNA, que inducen muy eficientemente el silenciamiento génico durante la infección. La disponibilidad de clones infecciosos de virus de plantas, que permiten la introducción de secuencias de exógenas, ha posibilitado el silenciamiento de genes del huésped, en plazos de tiempo muy reducidos (días). Sin embargo, la utilización de VIGS ha estado condicionada por la disponibilidad de clones infecciosos de virus que afecten especies de interés o que se acumulen en determinados tejidos. En el laboratorio disponemos de clones infecciosos para el virus del mosaico de la alfalfa (Alfalfa mosaic virus, AMV; género Alfamovirus) y el virus del mosaico del melocotonero (Peach mosaic virus, PcMV; género Trichovirus). Recientemente, hemos averiguado cómo modificar la proteína de movimiento de AMV (MP) sin afectar a su funcionalidad, permitiendo introducir secuencias de interés de hasta 200 residuos de nucleótidos. La MP del PcMV, al igual que la de AMV, pertenece a la familia 30K o conjunto de MPs virales de unos 30 kD que engloba a 18 géneros virales y cuyo miembro tipo es la MP del virus del mosaico del tabaco. Este hecho, sugiere que la MP del PcMV puede permitir la introducción de secuencias foráneas sin afectar a su funcionalidad, tal y como hemos observado con la MP de AMV. En el presente proyecto TFM abordaremos el desarrollo de los clones infecciosos de AMV y/o PcMV para su utilización como VIGS mediante la introducción de secuencias foráneas en la secuencia codificada la MP viral. Para ello, introduciremos secuencias de genes diana de la planta que den un fenotipo visible tras su silenciamiento, como la fitoeno desaturasa (phytoene desaturase, PDS). Delimitaremos la secuencia mínima requerida para inducir silenciamiento así como la región de la MP de PcMV que permite la introducción se secuencias exógenas. Ambos vectores se ensañarán en diferentes huéspedes tanto para hoja inoculada como sistémica. Fin