Experimental validation of tappAS: a computational framework to assess the functional impact of alternative splicing in a neural differentiation context

Abstract

[EN] Alternative splicing (AS) is a regulatory mechanism of gene expression that contributes to proteomic diversity by increasing the number of mRNA species that are transcribed from a single gene. As a result, varieties or isoforms of the same protein may present different structure, location and function. In addition, the variability in the expression rates of these isoforms can play an important role in the differentiation and in the determination of cell fate, in the appearance of diseases and can be used for the characterization of different cellular populations within a single one. TappAS is a Java application developed for the analysis of RNA-seq data at the gene and isoform level. It provides a set of tools to study the AS but also its functional implication, ie if this AS has any effect on a domain relevant to the functionality of the protein. The objective of this work is the validation of TappAS to reveal the effectiveness, specificity and sensitivity of the application to detect and evaluate expression rates at the isoform level. According to the literature, the levels of AS are particularly high in the nervous system, so that tappAS was evaluated in vitro in the context of the cellular differentiation of the nervous system. To this end, cultures of progenitor neural cells (NPCs) were established and cell differentiations were made from NPCs to oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) and motor neuron progenitors (MTNs). Subsequently, samples of RNA and proteins were collected at different times of differentiation to experimentally evaluate expression levels by RT-qPCR and Western Blot. The performed in silico analysis in our model have predicted AS events in genes involved in mitochondrial activity and dynamics (OMA1, MUL1) that could provide functional heterogeneity and energy supply throughout the differentiation process. The results obtained by RT-qPCR revealed the predicted isoforms and the gene expression rates obtained were similar to the theoretical data provided by TappAS. The knowledge of the mitochondrial quality control pathways and the abnormal mitochondrial dynamics and distribution could ultimately shed light on the effect of mitochondrial dysfunction in the development of neurological pathologies.

[ES] El empalme alternativo (EA) es un mecanismo regulador de la expresión génica que contribuye a la diversidad proteómica al aumentar el número de especies de ARNm que se transcriben a partir de un solo gen. Como resultado se sintetizan variedades o isoformas de una misma proteína con diferente estructura, localización y función. Además, la variabilidad en las tasas de expresión de estas distintas isoformas puede jugar un papel importante en la diferenciación y en la determinación del destino celular, así como en la aparición de enfermedades y puede servir para la caracterización de distintas poblaciones celulares dentro de un mismo tipo celular. TappAS es una aplicación java desarrollada para el análisis de datos obtenidos mediante RNA-seq a nivel de gen e isoforma. Proporciona un conjunto de herramientas para estudiar el EA pero también su implicación funcional, es decir si este EA tiene algún efecto en un dominio relevante para la funcionalidad de la proteína. El objetivo de este trabajo es la validación de TappAS para revelar la efectividad, especificidad y sensibilidad de la aplicación para detectar y evaluar las tasas de expresión al nivel de isoforma. Según la literatura, los niveles de EA son particularmente elevados en el sistema nervioso, por lo que tappAS se evaluó en el contexto de la diferenciación celular del sistema nervioso in vitro. Para ello se establecieron cultivos de células neurales progenitoras (NPCs) y se realizaron diferenciaciones celulares a partir de NPCs a células progenitoras de oligodendrocitos (OPCs) y progenitores de motoneuronas (MTNs). Posteriormente, se recogieron muestras de ARN y proteínas a distintos tiempos de las diferenciaciones para evaluar experimentalmente los niveles de expresión mediante RT-qPCR y Western Blot. Los análisis in silico realizados han predicho eventos de EA en genes implicados en la dinámica y actividad mitocondrial (OMA1, MUL1) que podrían proporcionar heterogeneidad funcional y suministro de energía a lo largo del proceso de diferenciación. Los resultados obtenidos por RT-qPCR revelaron las isoformas predichas y las tasas de expresión génica obtenidas fueron similares a los datos teóricos proporcionados por TappAS. El conocimiento de las vías de control de calidad mitocondrial y la dinámica y distribución mitocondriales anormales en última instancia podría arrojar luz sobre el efecto de la disfunción mitocondrial en el desarrollo de patologías neurológicas.