Caracterización de la interacción entre el canal de potasio de Arabidopsis thaliana KAT1 y su regulador BAG4

Abstract

[ES] El correcto funcionamiento de cualquier organismo requiere el mantenimiento de la homeostasis iónica, un proceso dinámico esencial que debe garantizar la presencia de iones a niveles adecuados, evitando su acumulación. Para ello, las células han desarrollado sistemas altamente eficientes que se encargan de captar y almacenar estos elementos, así como de permitir respuestas rápidas frente a posibles cambios ambientales. El potasio es el catión más abundante en las plantas, siendo también un nutriente esencial para estas. Tal es su importancia que juega un papel clave en funciones como la síntesis proteica, la activación enzimática o la turgencia celular. En relación con esta última, el flujo de potasio a través de las membranas de las células oclusivas regula su turgencia y, con ello, también la apertura o cierre estomáticos. Es a través de estas estructuras celulares, los estomas, que la célula es capaz de realizar tanto el intercambio gaseoso como la transpiración. La entrada de potasio en las células oclusivas viene regulada por distintos canales de entrada de potasio, entre estos se encuentra la familia Shaker de canales dependientes de voltaje. Pertenecientes a esta familia, en la membrana de las células oclusivas, se encuentran los principales responsables de dicha entrada de potasio: KAT1 y su homólogo KAT2. Dada su implicación directa en la apertura estomática, estos canales ganan importancia frente a un posible estrés abiótico como la sequía. En estudios previos, nuestro grupo identificó diferentes proteínas de Arabidopsis thaliana capaces de interaccionar con KAT1 mediante un rastreo basado en el sistema Split-Ubiquitina. Una de las proteínas identificadas fue BAG4, miembro de la familia BAG, que se caracteriza por un dominio BAG conservado cerca de la región C-terminal de sus proteínas. Este dominio interacciona directamente con una clase de las proteínas de choque térmico Hsp70, regulando así su actividad. En base a la función de sus homólogos en mamíferos y a distintas pruebas experimentales, se cree que esta familia está implicada en la regulación de procesos como la resistencia a patógenos o a estrés abiótico. También se demostró que BAG4 regula KAT1, de forma que su co-expresión mejora la actividad de KAT1, pero la falta de expresión de BAG4 lleva a un retraso en la apertura estomática. Por tanto, la caracterización detallada de la interacción entre KAT1 y BAG4, así como el estudio de los efectos que tiene en la capacidad reguladora de BAG4, pueden tener gran repercusión en los estudios de las respuestas de las plantas frente a la sequía. Mediante el sistema de clonación MoClo se diseñaron las construcciones necesarias para llevar a cabo esta caracterización. Las construcciones obtenidas se probaron, y los resultados preliminares muestran que las construcciones MoClo presentan una actividad reducida en el ensayo de interacción proteína-proteína Split-Ubiquitina, en comparación con los plásmidos control en base a los que se diseñaron. Sin embargo, observamos interacción entre KAT1 y BAG4, demostrando así la capacidad de estos plásmidos de ser usados para un análisis detallado de esta interacción.

[EN] The correct functioning of any type of organism requires the maintenance of ionic homeostasis. This is an essential, dynamic process that must guarantee the presence of ions at The correct functioning of any organism requires the maintenance of ionic homeostasis, an essential, dynamic process that must guarantee the presence of ions at adequate levels, preventing them from accumulating. To this end, cells have developed highly efficient systems that capture and store these elements, as well as allowing rapid responses to possible environmental changes. Potassium is the most abundant cation in plants, and is also an essential nutrient for them. This cation plays a key role in functions such as protein synthesis, enzyme activation or cell turgor. In relation to the latter, the flow of potassium through the membranes of the guard cells regulates their turgidity and, therefore, the opening or closing of the stomata. It is through these pore structures, the stomata, that the cell is able to perform both gas exchange and transpiration. The entry of potassium into the guard cells is regulated by different potassium entry channels, including the Shaker family of voltage-dependent channels. KAT1 and its close homologue KAT2 are Shaker family channels highly expressed in the guard cell membrane, that play a major role in potassium uptake in this cell type. Given their direct involvement in the stomatal opening, the regulation of the activity of these channels is crucial for the response to abiotic stresses such as drought. In previous studies, our group identified different proteins capable of interacting with KAT1 using a Split-ubiquitin screening in yeast. One of the identified proteins was BAG4, a member of the BAG family, which is characterized by a common BAG domain near the C-terminal region of these proteins. This characteristic domain interacts directly with the Heat Shock 70 (Hsp70) proteins, thus regulating their activity. Based on the role of their mammalian counterparts and various experimental tests, this family is believed to be involved in the regulation of processes such as resistance to pathogens or abiotic stress. In the same study, our group also proved that BAG4 regulates the KAT1 channel, so that its co-expression improves the KAT1 channel activity, whereas the lack of BAG4 expression caused altered stomatal movement. Thus, the characterization of the interaction between KAT1 and BAG4, as well as the study of its effects on the regulatory capacity of BAG4, could have great repercussions in the study of drought responses. Using the modular cloning system MoClo, the constructs needed to perform this characterization were designed. The completed plasmids were tested. Our preliminary results show that the MoClo constructs present a reduced activity in the Split-Ubiquitin protein-protein interaction assay, as compared to the control plasmids upon which our design was based. However, we could observe the protein-protein interaction between KAT1 and BAG4, demonstrating the utility os these constructs for the detailed analysis of this interaction.