Estudio del editado de genoma de precisión en Nicotiana benthamiana mediante el sistema prime editing

Abstract

[ES] Aunque mucha gente no es consciente de ello, la mejora genética de plantas ha sido aplicada desde los inicios de la agricultura. Desde siempre, se ha establecido una selección artificial, bien sea por la simple elección ejercida por los agricultores de las semillas más productivas o por la realización de cruces artificiales que no se dan en la naturaleza. Durante las últimas décadas, una forma de selección adicional a las ya existentes ha sufrido un crecimiento exponencial. La rápida evolución de las técnicas de la biología molecular ha potenciado a la ingeniería genética hasta límites inimaginables. La ingeniería genética se basa en el uso de la biotecnología para la manipulación dirigida de genes con el propósito de, entre otros, superar los límites reproductivos entre especies diferentes transfiriéndolos de unas a otras, induciendo mutantes con genes silenciados o incluso sobreexpresándolos. Entre todos los aspectos positivos que la ingeniería genética de plantas aporta a la agricultura, merece destacar su capacidad de incrementar los rendimientos de producción, el contenido nutricional de los productos obtenidos o la resistencia a plagas. En general, la edición genética se ha llevado a cabo utilizando nucleasas que permiten inserciones, deleciones y sustituciones específicas de secuencia. Para ello, estas enzimas desencadenan roturas de doble cadena (DSBs) del DNA que pueden ser reparadas, o bien mediante la unión de los extremos no homólogos (NHEJ), o bien mediante la reparación dirigida por homología (HDR), promoviendo así las mutaciones anteriormente mencionadas. Tradicionalmente, los ingenieros genéticos han utilizado meganucleasas, nucleasas de actividad similar a activador de transcripción (TALENs) y nucleasas con dedos de zinc (ZFNs), cada una con sus propias ventajas y desventajas. A pesar del espectacular progreso que se ha conseguido gracias a su uso, una tecnología posteriormente desarrollada que consiste en una nucleasa Cas 9 asociada a CRISPR procedente de Streptococcus pyogenes ha mejorado incluso todas sus ventajas. El sistema CRISPR-Cas ha revolucionado por completo el mundo de la ingeniería genética ya que se basa en la simple complementariedad de bases entre un RNA previamente diseñado y la secuencia de DNA que se desea editar, sin considerar las interacciones proteína-DNA necesarias para las anteriores nucleasas. Sin embargo, el progreso científico ha avanzado un paso más desarrollándose así diferentes aplicaciones del sistema CRISPR-Cas. Las más remarcables son base editing y su nueva versión mejorada conocida como prime editing . Dichas técnicas son capaces de inducir ediciones del genoma sin requerir roturas de doble cadena o secuencias de DNA que actúen como molde. Específicamente, prime editing se compone de la endonucleasa Cas9 unida a una retrotranscriptasa programada con el fin de unirse a la secuencia diana e inducir la edición deseada a partir de la información proporcionada por el guía de RNA de prime editing . El objetivo del presente estudio es el desarrollo de las herramientas necesarias para aplicar la recientemente publicada técnica del prime editing en Nicotiana benthamiana. Tras la pertinente búsqueda bibliográfica, se han identificado y analizado diferentes candidatos potencialmente útiles para futuros usos. Entre todos ellos, los genes de la Acetolactato Sintasa y los del Flowering Locus T-5 han sido seleccionados para diseñar los guías de RNA y planificar los experimentos necesarios con el fin de probar la técnica.

[EN] Although many people are not aware of, plant breeding started at the very beginning of agriculture. A non-naturally occurring selection has always been stablished either by farmer s seed choice or induced plant crosses. During the last decades, an additional way of selecting plants for the desired traits has experienced an exponential growth. The rapid evolution of molecular biology-based techniques has boosted genetic engineering till unexpected limits. Genetic engineering involves the use of biotechnology for direct manipulation of genes aiming, for instance, to transfer them across species boundaries, to knockout, to edit or to overexpress them. Among all possible benefits of plant genetic engineering to agriculture, it should be remarked its ability to increase crop production yields, nutritional content and pest resistance. In general, gene editing has been carried out using specific nucleases that allow targeted insertions, deletions and precise sequence substitutions. To do so, those enzymes trigger double-strand breaks (DSBs) in the DNA that can be repaired either by non-homologous end joining (NHEJ) or by homology-directed repair (HDR), thus promoting the previously mentioned mutations. Traditionally, genetic engineers have used meganucleases, transcription activator like effector nucleases (TALENs) and zinc finger nucleases (ZFNs), each of them presenting their own set of advantages and drawbacks. In spite of the spectacular progress achieved with their application, an afterwards developed technology consisting of a bacterial CRISPR-associated protein 9 nuclease from Streptococcus pyogenes exceeded all their benefits. CRISPR-Cas system has completely revolutionized Genetic Engineering since it is an RNA-based nuclease that relies on base-paring rules between an engineered RNA and the desired target DNA site to be mutated rather than protein-DNA interaction needed for the previous nucleases. However, scientific progress has gone a step further and new applications derived from CRISPR-Cas system have been developed. The most remarkable ones are base editing and its newly enhanced version prime editing. These techniques are able to induce direct genome edits without requiring DSBs or donor DNA templates. Specifically, prime editing is composed by a Cas9 endonuclease paired to a programmed reverse transcriptase able to both fuse to the target site and promote the desired edit with the information provided by a prime editing guide RNA. The aim of this study is to design the proper tools for applying the recently published prime editing technique in Nicotiana benthamiana. From a deep bibliographical search, several potential candidates have been considered and analysed for future applications of this method. Among all of them, the Acetolactate Synthase and the Flowering Locus T-5 genes have been selected for designing the necessary guide RNAs and planning the experiments for testing the technique.