Análisis de Genes Candidatos de QTLs para la Composición de la Microbiota Intestinal del Cerdo

Abstract

[ES] La microbiota intestinal es un ecosistema complejo y dinámico con un papel muy importante en el desarrollo del animal en las diferentes etapas en el ciclo productivo. Además, la interacción de estos microorganismos con los receptores en la mucosa gástrica influye en alto grado en la expresión génica del hospedador. Este proyecto parte de una investigación de Crespo-Piazuelo et al., (2019) donde se identificaron regiones genómicas asociadas con la composición de varios géneros bacterianos. Los genes candidatos del genoma porcino se seleccionaron por posición y función para cada género microbiano: Streptococcus (UROS), Akkermansia (CHST12), Phascolarctobacterium (ST14, IKBKE, JAM3), y Prevotella (MAN2B2). Se utilizó cDNA para el gen UROS Y DNA genómico para los genes CHST12, MAN2B2, ST14, IKBKE Y JAM3 de un material animal Duroc x Ibérico, 16 animales extremos para la abundancia relativa de cada género microbiano (8 de la línea alta, 8 de la línea baja). Para identificar los polimorfismos genéticos ya anotados en estos genes se utilizó la aplicación BioMartTool de Ensembl Project (www.ensembl.org) para cada gen y se hizo la correspondiente predicción del efecto de los SNPs. Se seleccionaron preferentemente SNPs de interés que determinaban un cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Se diseñaron los primers para amplificar las regiones genómicas de interés por medio de la reacción de la cadena de la polimerasa (PCR) mediante la aplicación Web Primer3Plus y se secuenciaron por el método Sanger. Las secuencias obtenidas se alinearon por medio del software SEQUENCHER 5.4.6 y se visualizaron y anotaron los SNPs en el genoma de los genes UROS, IKBKE, ST14 y JAM3. El gen UROS presento 16 polimorfismos para un solo individuo, sin arrojar información de importancia. Para los demás genes se encontraron 3 SNPs de interés. El primero se encuentra en el gen JAM3, común para siete de los ocho animales de la línea alta en abundancia del género bacteriano Phascolarctobacterium. Este polimorfismo no está anotado en Ensembl y determina cambio de aminoácido y se encuentra en la posición 9:60706769 bp, en el exón 5. El segundo SNP se localiza en el gen ST14, exón 16. Este se encuentra anotado en Ensembl (rs319985414, synonymous_variant) y no determina un cambio de aminoácido. Es un polimorfismo presente en cuatro animales de la línea baja y cuatro animales de la línea alta para el género Phascolarctobacterium. El tercer SNP se localiza en el gen IKBKE, exón 8, determina un cambio de aminoácido en la proteína y se encuentra en tres animales de la línea baja y cinco de la línea alta para la abundancia del genero Phascolarctobacterium. Este SNP se encuentra anotado en Ensembl (rs707345016, missense_variant). Las variantes genéticas en estos genes podrían ser importantes en la modulación y control de la microbiota intestinal. Sin embargo, es necesario validar en un mayor número de animales la asociación entre la composición de la microbiota y los polimorfismos genéticos encontrados.

[EN] The gut microbiota is a complex and dynamic ecosystem with a very important role in the development of the animal at different stages in the production cycle. Furthermore, the interaction of these microorganisms with the receptors in the gastric mucosa greatly influences the gene expression of the host. This project starts from an investigation by Crespo-Piazuelo et al., (2019) where genomic regions associated with the composition of various bacterial genera were identified. Porcine genome candidate genes were selected by position and function for each microbial genus: Streptococcus (UROS), Akkermansia (CHST12), Phascolarctobacterium (ST14, IKBKE, JAM3), and Prevotella (MAN2B2). CDNA was used for the UROS gene and genomic DNA for the CHST12, MAN2B2, ST14, IKBKE and JAM3 genes from a Duroc x Iberian animal material, 16 extreme animals for the relative abundance of each microbial genus (8 from the high line, 8 from the line down). To identify the genetic polymorphisms already noted in these genes, the BioMartTool application from Ensembl Project (www.ensembl.org) was used for each gene and the corresponding prediction of the effect of the SNPs was made. SNPs of interest were preferably selected which determined a change in the amino acid sequence of the protein. Primers were designed to amplify the genomic regions of interest by means of the polymerase chain reaction (PCR) using the Primer3Plus Web application and were sequenced by the Sanger method. The sequences obtained were aligned by means of the SEQUENCHER 5.4.6 software and the SNPs in the genome of the UROS, IKBKE, ST14 and JAM3 genes were visualized and annotated. The UROS gene presented 16 polymorphisms for a single individual, without yielding important information. For the other genes, 3 SNPs of interest were found. The first is found in the JAM3 gene, common to seven of the eight abundant high-line animals of the bacterial genus Phascolarctobacterium. This polymorphism is not annotated in Ensembl and determines amino acid change and is found at position 9: 60706769 bp, in exon 5. The second SNP is located in the ST14 gene, exon 16. This is annotated in Ensembl (rs319985414, synonymous_variant ) and does not determine an amino acid change. It is a polymorphism present in four low line animals and four high line animals for the genus Phascolarctobacterium. The third SNP is located in the IKBKE gene, exon 8, determines an amino acid change in the protein and is found in three animals from the low line and five from the high line for the abundance of the Phascolarctobacterium genus. This SNP is annotated in Ensembl (rs707345016, missense_variant). The genetic variants in these genes could be important in the modulation and control of the intestinal microbiota. However, it is necessary to validate in a larger number of animals the association between the composition of the microbiota and the genetic polymorphisms found.

[CA] La microbiota intestinal és un ecosistema complex i dinàmic amb un paper molt important en el desenvolupament de l'animal en les diferents etapes en el cicle productiu. A més, la interacció d'aquests microorganismes amb els receptors en la mucosa gàstrica influeix enlaire grau en l'expressió gènica de l'hoste. Aquest projecte parteix d'una investigació de Crespo-Piazuelo et al., (2019) on es van identificar regions genòmiques associades amb la composició de diversos gèneres bacterians. Els gens candidats del genoma porcí es van seleccionar per posició i funció per a cada gènere microbià: Streptococcus (UROS), Akkermansia (CHST12), Phascolarctobacterium (ST14, IKBKE, JAM3), i Prevotella (MAN2B2). Es va utilitzar cDNA per al gen UROS I DNA genómico per als gens CHST12, MAN2B2, ST14, IKBKE I JAM3 d'un material animal Duroc x Ibèric, 16 animals extrems per a l'abundància relativa de cada gènere microbià (8 de la línia alta, 8 de la línia baixa). Per a identificar els polimorfismes genètics ja anotats en aquests gens es va utilitzar l'aplicació BioMartTool de Ensembl Project (www.ensembl.org) per a cada gen i es va fer la corresponent predicció de l'efecte dels SNPs. Es van seleccionar preferentment SNPs d'interés que determinaven un canvi en la seqüència d'aminoàcids de la proteïna. Es van dissenyar els primers per a amplificar les regions genòmiques d'interés per mitjà de la reacció de la cadena de la polimerasa (PCR) mitjançant l'aplicació Web Primer3Plus i es van seqüenciar pel mètode Sanger. Les seqüències obtingudes es van alinear per mitjà del programari SEQUENCHER 5.4.6 i es van visualitzar i van anotar els SNPs en el genoma dels gens UROS, IKBKE, ST14 i JAM3. El gen UROS presente 16 polimorfismes per a un sol individu, sense llançar informació d'importància. Per als altres gens es van trobar 3 SNPs d'interés. El primer es troba en el gen JAM3, comú per a set dels huit animals de la línia alta en abundància del gènere bacterià Phascolarctobacterium. Aquest polimorfisme no està anotat en Ensembl i determina canvi d'aminoàcid i es troba en la posició 9:60706769 bp, en l'exó 5. El segon SNP es localitza en el gen ST14, exó 16. Aquest es troba anotat en Ensembl (rs319985414, synonymous_variant) i no determina un canvi d'aminoàcid. És un polimorfisme present en quatre animals de la línia baixa i quatre animals de la línia alta per al gènere Phascolarctobacterium. El tercer SNP es localitza en el gen IKBKE, exó 8, determina un canvi d'aminoàcid en la proteïna i es troba en tres animals de la línia baixa i cinc de la línia alta per a l'abundància del genere Phascolarctobacterium. Aquest SNP es troba anotat en Ensembl (rs707345016, missense_variant). Les variants genètiques en aquests gens podrien ser importants en la modulació i control de la microbiota intestinal. No obstant això, és necessari validar en un major nombre d'animals l'associació entre la composició de la microbiota i els polimorfismes genètics oposats.