Estimulación optogenética de células progenitoras neurales como mejora neurorregenaradora en el tratamiento de la lesión medular

Abstract

[ES] La lesión medular implica consecuencias sanitarias, sociales y psicológicas considerables, ya que el daño a la médula espinal puede resultar en disfunción motora, sensorial y/o autonómica permanente. Sin embargo, aún no existe ninguna terapia efectiva que permita una recuperación funcional considerable de los pacientes con lesión medular. Actualmente, una de las aproximaciones terapéuticas más prometedoras bajo investigación es la terapia celular, en la cual el trasplante de células progenitoras neurales (NPCs) ependimarias que recubren el canal central de la médula espinal está mostrando resultados esperanzadores. El trasplante de NPCs representa una potencial terapia dirigida a reemplazar el tejido neural perdido y modular el microambiente de la lesión reduciendo las barreras a la neurorregeneración y/o promoviéndola. No obstante, aún se requiere mucho trabajo para superar sus limitaciones (como una supervivencia pobre o una integración funcional reducida), las cuales evidencian la necesidad de combinación con estrategias adicionales. En este trabajo, proponemos la optogenética como candidata para mejorar los resultados de la terapia celular. La optogenética representa una aproximación innovadora que combina métodos ópticos y genéticos. Mediante la expresión ectópica de proteínas fotosensibles, esta técnica permite un control temporal y espacial preciso de poblaciones celulares específicas al ser fotoestimuladas. Las proteínas fotosensibles más comúnmente empleadas son las opsinas microbianas, que son canales iónicos regulados por luz que posibilitan el control del flujo iónico a través de la membrana celular y la generación de potenciales de acción en circuitos neuronales. Basándonos en estudios previos, hipotetizamos que la estimulación optogenética de NPCs in vitro antes del trasplante o in vivo tras el trasplante podría aumentar sus capacidades neurorregeneradoras, concretamente promoviendo la supervivencia y proliferación, mejorando el crecimiento de neuritas y la integración funcional, aumentando la secreción de factores neurotróficos y fomentando la diferenciación de NPCs a neuronas y oligodendrocitos. En base a esta hipótesis, el objetivo de este trabajo era estudiar el efecto de la estimulación optogenética in vitro sobre las NPCs ependimarias. NPCs procedentes de cultivo primario fueron transducidas empleando un vector viral adeno-asociado para expresar ectópicamente la opsina excitatoria canalrodopsina-2 (ChR2). El análisis por citometría de flujo reveló la expresión exitosa de ChR2 marcada con mCherry, aunque la eficiencia de transducción fue baja. Los ensayos de viabilidad demostraron que la expresión ectópica de ChR2-mCherry no estaba afectando a la viabilidad de las NPCs. La estimulación optogenética in vitro de NPCs en condiciones de proliferación promovió su capacidad para formar neuritas, aunque no aumentó su proliferación y viabilidad. Asimismo, la estimulación optogenética in vitro de NPCs en condiciones de diferenciación fomentó su diferenciación a oligodendrocitos y neuronas, que además mostraron una longitud y ramificación axonales aumentadas. Del mismo modo, la morfología predominante de los astrocitos derivados de NPCs cambió de una morfología protoplásmica a una fibrosa. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se estudia la aplicación de la optogenética en el contexto de las terapias celulares para tratar la lesión medular. Nuestros resultados ponen de manifiesto su gran potencial como mejora neurorregeneradora en el tratamiento de la lesión medular.

[EN] Spinal cord injury (SCI) implies remarkable health, social and psychological consequences, since damage to the spinal cord can result in permanent motor, sensory and/or autonomic dysfunction. However, still no effective therapy that allows considerable functional recovery of SCI patients exists. Currently, one of the most promising therapeutic approaches under investigation is cell therapy, where transplantation of ependymal neural progenitor cells (NPCs) lining the central canal of the spinal cord is showing encouraging results. NPC transplantation represents a potential therapy aimed at replacing the lost neural tissue and modulating the lesion microenvironment reducing the barriers to neuroregeneration and/or promoting it. Nonetheless, still much work is needed to overcome its limitations (such as poor survival or reduced functional integration), which make evident the need for combination with additional strategies. In this work, we propose optogenetics as a candidate to improve cell therapy outcomes. Optogenetics represents an innovative approach combining optical and genetic methods. Through the ectopic expression of photosensitive proteins, this technique allows for a precise temporal and spatial control of specific cell populations upon photostimulation. The most commonly used photosensitive proteins are microbial opsins, which are light-gated ion channels that enable the control of cell membrane ion flux and the generation of action potentials in neuronal circuits. Based on previous studies, we hypothesised that optogenetic stimulation of NPCs in vitro before transplant or in vivo after transplant might increase their neuroregenerative capabilities, namely promoting survival and proliferation, improving neurite growth and functional integration, increasing the secretion of neurotrophic factors and enhancing NPC differentiation into neurons and oligodendrocytes. Based on this hypothesis, the aim of this work was to study the effect of in vitro optogenetic stimulation on ependymal NPCs. Primary cultured NPCs were transduced using an adeno-associated viral vector to ectopically express the excitatory opsin channelrhodopsin-2 (ChR2). Flow cytometry analysis revealed successful mCherry-tagged ChR2 expression, although transduction efficiency was low. Viability assays showed that ectopic ChR2-mCherry expression was not affecting NPC viability. In vitro optogenetic stimulation of NPCs under proliferation conditions promoted their capability to grow neurites, although it did not increase their proliferation and viability. Furthermore, in vitro optogenetic stimulation of NPCs under differentiation conditions enhanced their differentiation into oligodendrocytes and neurons, which moreover displayed an increased axon length and branching. Also, the predominant morphology of NPC-derived astrocytes changed from a protoplasmic to a fibrous morphology. To our knowledge, this is the first time that the application of optogenetics is studied in the context of cell therapies to treat SCI. Our results highlight its great potential as a neuroregenerative improvement in the treatment of SCI.