Selection and assessment of bacteriophages against salmonella spp. in the poultry industry

Abstract

[ES] Salmonella es una de las principales causas de toxiinfecciones alimentarias en el mundo. En Europa, en el último año tuvo lugar un total de 94.203 casos de salmonelosis, de los cuales 8.730 fueron en España. La principal fuente de la infección son los productos de origen animal, principalmente los huevos y la carne de pollo. Los Programas Nacionales de Control de Salmonella, han logrado reducir la prevalencia de la bacteria a nivel de campo. Sin embargo, cada año siguen surgiendo nuevos casos de salmonelosis en la especie humana, y se sigue detectando la presencia de la bacteria en las explotaciones avícolas. Por ello, se continúan buscando nuevas alternativas en la lucha contra la bacteria, como puede ser el empleo de bacteriófagos. Los bacteriófagos o fagos son virus ubicuos en el ambiente que están ampliamente distribuidos en la naturaleza. Son microorganismos que atacan específicamente a bacterias, alterándolas hasta destruirlas. Estas características hacen de los fagos una herramienta muy prometedora para la eliminación de Salmonella en explotaciones avícolas como medida complementaria a la limpieza y desinfección, y como una herramienta más de control para incluir en las buenas prácticas de higiene a nivel de campo. En este contexto, en esta tesis doctoral hemos centrado nuestros estudios en conocer la diversidad fágica en las explotaciones avícolas y estudiar la aplicación de la terapia fágica para el control de Salmonella como medida complementaria a la limpieza y desinfección. Para ello, se realizaron tres experimentos durante el periodo de enero de 2017 y diciembre de 2019, en los que se aislaron y multiplicaron fagos de muestras procedentes de granjas avícolas. El objetivo del primer experimento fue evaluar la prevalencia de fagos frente a Salmonella en granjas comerciales de gallinas ponedoras y broilers. Los resultados de este estudio indican que las granjas avícolas podrían representar una importante fuente de fagos de Salmonella. Además, se ha observado una estrecha relación entre la prevalencia de fagos frente a Salmonella y la prevalencia de serotipos de Salmonella en las granjas avícolas, lo que sugiere que los fagos coexisten con su serotipo. su concentración y aplicarlos frente a las mismas granjas avícolas positivas a Salmonella. El objetivo del segundo experimento fue evaluar el efecto de los fagos contra Salmonella Infantis y Salmonella Enteritidis en las superficies de las granjas, y evaluar la aplicación del procedimiento de los fagos como desinfectante contra Salmonella en las condiciones de campo. Se observó una reducción de la concentración de S. Infantis y S. Enteritidis en las superficies de la nave en 4,55 log10 UFC/mL y 3,85 log10 UFC/mL, respectivamente. La mayor reducción para ambos serotipos se obtuvo el 5º día después de la primera aplicación. Estos resultados ponen de manifiesto que los fagos podrían ser una herramienta prometedora para utilizar en combinación con los procedimientos de limpieza y desinfección. Por último, el objetivo del tercer experimento fue evaluar la aplicación experimental de los autofagos para el control de S. Enteritidis en una granja de gallinas ponedoras contaminada de forma natural. Este estudio pone en evidencia que los autofagos se podrían emplear, no solo como una medida para reducir la excreción de Salmonella por parte de los animales infectados, sino como medida complementaria en la limpieza y desinfección de las instalaciones con una gran eficacia. Además, el hecho de que el autofago eliminara la Salmonella del medio ambiente, aún con los animales en el interior de la nave, podría evitar la re-contaminación horizontal entre animales infectados y no infectados. Los resultados más relevantes que se han obtenido de esta tesis doctoral es que el sector avícola dispone de una herramienta prometedora, económica y ecológica capaz de reducir significativamente la prevalencia de Salmonella cuando las medida

[EN] Millions of human salmonellosis cases are reported worldwide every year, and the disease results in thousands of deaths. In 2018, a total of 94,203 confirmed cases in humans were reported in Europe of which 8,730 were in Spain. The main source of infection is poultry products as eggs and chicken meat. National Salmonella Control Programmes have succeeded in reducing the prevalence of the bacteria at the field level. However, new cases of salmonellosis in humans continue to emerge every year and the presence of the bacterium continues to be detected in poultry farms. Therefore, new alternatives continue to be sought in the fight against the bacteria, such as the use of bacteriophages. Bacteriophages or phages are ubiquitous viruses in the environment and are widely distributed in nature. They are microorganisms that specifically attack bacteria, altering them until they are destroyed. These characteristics make phages a very promising tool for the elimination of Salmonella in poultry farms as a complementary tool for cleaning and disinfection, and as another control tool to be included in good hygiene practices at field level. Thus, in this doctoral thesis, we have focused our studies on determining the phage diversity in poultry farms and studying the application of phage therapy for the control of Salmonella as a complementary measure to cleaning and disinfection. To this end, three experiments were carried out during the period from January 2017 to December 2019, where phages were isolated, purified, and multiplied from different samples taken from poultry farms and their epidemiology was studied. The objective of the first experiment was to assess Salmonella-phage prevalence in commercial poultry farms in terms of the production livestock type: layers or broilers. The results of this study indicated that poultry farms could represent an important source of Salmonella phages. Moreover, we have shown a close relationship between Salmonella phage prevalence and Salmonella serovar prevalence in poultry farms, suggesting that phages co-exist within their serovar. The purpose of the second experiment was to assess the effect of phages against Salmonella Infantis and Salmonella Enteritidis on farm surfaces and evaluate phage application procedure as sanitiser against Salmonella in field conditions. Results showed S. Infantis and S. Enteritidis decreased by 4.55 log10 CFU/mL and 3.85 log10 CFU/mL, respectively; the maximum reduction in Salmonella was on the 5th day, after 108 PFU/mL and 103 PFU/mL phage application. These results highlight phages as a promising tool together with cleansing and disinfection. However, more studies are needed to demonstrate their efficacy as sanitisers in poultry farms. Finally, the aim of the third experiment was to assess the application of autophages for the control of S. Enteritidis in a naturally contaminated laying hen farm. This study shows that autophages could be used not only as a measure to reduce the excretion of Salmonella by infected animals but also as a complementary measure in the cleaning and disinfection of the facilities. In addition, the fact that autophages eliminated the Salmonella from the environment, even with the animals inside the facility, could avoid horizontal transmission of Salmonella among infected and non-infected animals. The most relevant results obtained from this doctoral thesis are that the poultry sector has a promising, economic and ecological tool, as phage therapy, able to significantly reduce the prevalence of Salmonella when current measures cannot eliminate it from poultry farms.

[CA] Salmonella és una de les principals causes de toxiinfeccions alimentàries en el món. En A Europa, en l'últim any es van reportar 94.203 casos, dels quals 8.730 es van produir a Espanya. La principal font d'infecció són els productes d'origen animal, principalment els ous i la carn de pollastre. Els Programes Nacionals de Control de Salmonella han aconseguit reduir la prevalença a nivell de camp. No obstant, cada any continuen sorgint nous casos de salmonel·losi, i es continua detectant la presència de la bacteria en algunes explotacions avícoles. Per això, es continua buscant noves alternatives en la lluita contra la bacteria, com pot ser l'ocupació d'additius en el pinso, un bon maneig a nivell de camp o l'ús de bacteriòfags. Els bacteriòfags o fags són virus ubics en l'ambient i es troben àmpliament distribuïts en la naturalesa. Són microorganismes que ataquen específicament a les bacteries, alterant-les fins a destruir-les. Estes característiques fan dels bacteriòfags una ferramenta molt prometedora per a l'eliminació de Salmonella en explotacions avícoles com a mesura complementària a la neteja i desinfecció i com una ferramenta més de control per a incloure en les bones pràctiques d'higiene. En este context, en esta tesi doctoral hem centrat els nostres estudis a conèixer la diversitat fàgica en les explotacions avícoles i estudiar l'aplicació de la teràpia fágica per al control de Salmonella com a mesura complementària a la neteja i desinfecció. Per a això, es van realitzar tres experiments durant el període de gener de 2017 i desembre de 2019, en els que es van aïllar y multiplicar bacteriòfags de diferents mostres procedents de granges avícoles. L'objectiu del primer experiment va ser avaluar la prevalença de bacteriòfags enfront de Salmonella en granges comercials de gallines ponedores i pollastres. Els resultants de este estudi indiquen que les granges avícoles podrien representar una important font enfront de bacteriòfags de Salmonella. A més, s'ha observat una estreta relació entre la prevalença de bacteriòfags enfront de Salmonella i la prevalença de serotips de Salmonella en les granges avícoles, la qual cosa suggereix que els bacteriòfags coexisteixen amb el seu serotip. L'objectiu del segon experiment va ser avaluar l'efecte dels bacteriòfags contra Salmonella Infantis i Salmonella Enteritidis en les superfícies de les granges, i avaluar l'aplicació del procediment dels bacteriòfags com a desinfectant contra Salmonella en les condicions de camp. La concentració de Salmonella Infantis i Salmonella Enteritidis va disminuir 4,55 log10 UFC/mL i 3,85 log10 UFC/mL, respectivament, després de dos aplicacions consecutives de bacteriòfags. La major reducció de S. Infantis i S. Enteritidis es va obtindre el 5º dia després de la primera aplicació. Estos resultats manifesten que els bacteriòfags són una ferramenta prometedora per a utilitzar en combinació amb els procediments de neteja i desinfecció. Finalment, l'objectiu del tercer experiment va ser avaluar l'aplicació experimental dels autòfags per al control de S. Enteritidis en una granja de gallines ponedores. Este estudi posa en evidència que els autofagos es podrien emprar com a mesura complementària en la neteja i desinfecció de les instal·lacions amb una gran eficàcia i per a reduir els recomptes de Salmonella en animals infectats. A més, el fet de que l'autòfag eliminarà la Salmonella del medi ambient, encara amb els animals en l'interior de la nau, podria evitar la recontaminació horitzontal entre animals infectats i no infectats. Els resultats més rellevants que s'han obtingut d'esta tesi doctoral és que el sector avícola disposa d'una ferramenta prometedora, econòmica i ecològica capaç de reduir significativament la prevalença de Salmonella quan les mesures actuals no són capaços d'eliminar-la de les granges avícoles.