Developmental plasticity and transgenerational reprogramming following vitrified embryo transfer in Oryctolagus cuniculus

Abstract

[ES] Las tecnologías de reproducción asistida suponen un cambio drástico en el entorno natural del embrión, al no conseguir imitar las condiciones maternales óptimas, por lo que su aplicación implica consecuencias para el desarrollo del organismo. El objetivo general de esta tesis fue estudiar los efectos a largo plazo y transgeneracionales del estrés provocado durante un procedimiento de transferencia de embriones vitrificados, utilizando el conejo como modelo animal.

En el Capítulo I, demostramos que la transferencia de mórulas tempranas o compactas resulta en tasas de supervivencia al parto > 70% en fresco y > 55% tras la vitrificación. La facilidad con la que se pueden realizar estos procedimientos, el elevado número de descendientes que podemos obtener y el corto ciclo de vida del conejo, fomentaron y facilitaron los siguientes estudios.

En el Capítulo II, se compararon las diferencias en el desarrollo a corto y largo plazo entre los animales nacidos de embriones transferidos en fresco (FT) o tras su vitrificación (VT), utilizando una población concebida de forma natural (NC) como referencia. Tanto las tasas de supervivencia prenatal, como el rendimiento del crecimiento postnatal, se redujeron significativamente a medida que aumentó la manipulación embrionaria (NC<FT<VT). Además, comparamos el efecto de dos dispositivos de vitrificación, observando que, aunque el cryotop ejerció un efecto positivo sobre la supervivencia fetal, implicó mayores desviaciones fenotípicas (rendimiento de crecimiento y lactancia) postnatalmente que el dispositivo de la ministraw. Sin embargo, todas las progenies fueron sanas y fértiles. Por lo tanto, estos resultados demostraron la gran plasticidad del embrión de mamífero.

El objetivo del Capítulo III fue evaluar los efectos del procedimiento de transferencia de embriones vitrificados (VET) en el desarrollo, comparando animales VT y NC. Así, detectamos que los animales VT presentaron alteraciones del peso al nacer y del patrón de crecimiento, viéndose los machos más afectados que las hembras. En la edad adulta, los machos VT presentaron un menor peso corporal, del hígado y del corazón. Un análisis proteómico hepático mostró cambios en relación con la fosforilación oxidativa y el metabolismo de los lípidos y el zinc. Mediante un análisis de sangre, se comprobó que el estado de salud entre los animales VT y NC fue comparable.

En el Capítulo IV, se constituyó un modelo de tres generaciones (F1, F2 y F3) para evaluar los efectos transgeneracionales del VET. Los resultados mostraron que los efectos directos (F1) del VET fueron intergeneracionales (F2) y transgeneracionales (F3), ya que las progenies VT mostraron alteraciones en el crecimiento, peso corporal adulto y peso hepático. Un estudio molecular (transcriptómico y metabolómico) del tejido hepático reveló alteraciones en el metabolismo del zinc y los ácidos grasos insaturados a través de las generaciones, correlacionado con el fenotipo VT. No obstante, la fertilidad fue similar entre los machos VT y NC en cada generación, denotando un buen estado de salud.

Finalmente, en el Capítulo V, mediante un enfoque comparativo multi-ómico (metabolómico, proteómico y epigenómico) del tejido hepático entre animales F3-VT y F3-NC, se demostró una alteración global de la fisiología molecular en los animales VT, relacionada principalmente con el metabolismo de los lípidos (ácidos grasos poliinsaturados, esteroides, hormonas esteroides...). Además, se detectaron amplios cambios en el epigenoma hepático, demostrando la herencia transgeneracional de los cambios moleculares inducidos por el VET en los embriones de la F1. El estado de salud fue similar entre los animales VT y NC.

A lo largo de esta tesis se ha demostrado, por primera vez, que el VET induce una reprogramación embrionaria del desarrollo que persiste hasta la edad adulta y en las generaciones posteriores. Se cree que los mecanismos epigenéticos median esta plasticidad del desarrollo y su herencia transgeneracional, un hecho también avalado por nuestros resultados. Por lo tanto, los diferentes campos que actualmente se nutren de la criopreservación y transferencia de embriones, como la medicina y la producción animal, deberían evaluar cómo estos procedimientos pueden afectar a la eficiencia o la consecución de sus objetivos.

[EN] Assisted reproductive technologies involve the furthest change from the natural environment by failing to mimic optimal maternal conditions, and thereby entail consequences for late development. The general aim of this thesis was to study the long-term and transgenerational effects of the in vitro stressors occurring during a vitrified embryo transfer procedure on the rabbit model.

In Chapter I, we prove that transferring early or compact morula leads to rates of survival at birth >70% in fresh and >55% after vitrification. The ease of performing both embryo cryopreservation and embryo transfer procedures, the high numbers of descendants that we are able to obtain and the short life cycle of the rabbit encouraged and facilitated the following studies.

Chapter II was designed to compare the short and long-term developmental differences between animals born from fresh-transferred (FT) and vitrified-transferred (VT) embryos, using a naturally conceived (NC) population as control reference. Both prenatal survival rates and growth performance were significantly reduced as embryo manipulation was increased (NC<FT<VT). In addition, we compare the effect of two vitrification devices, noting that although cryotop exerted a positive effect on foetal survival, incurred higher phenotypic (growth and lactation performances) deviations postnatally than the straw device. Then, the choice of vitrification device is not trivial. However, all progenies were healthy and fertile. Therefore, these results demonstrated the high developmental plasticity of the mammalian embryo under different in vitro stressors.

The aim of Chapter III was to evaluate the effects of the entire vitrified embryo transfer procedure (VET) on development, detecting that VT animals have modifications of the birth weight and growth pattern, but males were more affected than females. At adulthood, VT males were smaller and showed a significantly lower liver and heart weight than NC males. A comparative proteomic analysis showed changes in relation to oxidative phosphorylation and dysregulations in the zinc and lipid metabolism. However, a blood analysis (haematological and biochemical) revealed that health status was comparable between VT and NC animals.

In Chapter IV, a three generation (F1, F2 and F3) model was constituted in order to assess the transgenerational effects of the VET. The results showed that direct (F1) effects of the VET were also intergenerational (F2) and transgenerational (F3), as VT progenies exhibited alterations in the growth velocity, adult body weight and liver weight in each generation. A comparative molecular (transcriptomic and metabolomics) study in the liver tissue unveiled alterations in the zinc and unsaturated fatty acid metabolism across the generations, which can be correlated with the VT phenotype. Nonetheless, similarities in the fertility between VT males and their NC counterparts in each generation denote that VET did not seem to impair the health status in the VT animals.

Finally, in Chapter V, a comparative multi-omic (metabolomic, proteomic and epigenomic) approach was performed in the liver tissue between F3-VT and F3-NC animals. Both metabolomic and proteomic analyses showed global alteration in the hepatic metabolism of VT animals, mainly related to lipid metabolism (e.g. polyunsaturated fatty acids, steroids, steroid hormones¿). In addition, broad methylation changes were detected in the hepatic epigenome, involving genes related with lipid metabolism and apoptosis. These data demonstrated the transgenerational inheritance of the changes induced by VET in ancestors' embryos. The healthy status was similar between VT and NC animals.

Through this thesis, it has been demonstrated for the first time that VET induces a developmental reprogramming that persists until adulthood and in subsequent generations, incurring long-term consequences for the phenotype and the molecular physiology of the resultant offspring.

[CA] Les tecnologies de reproducció assistida suposen un canvi dràstic en l'entorn natural de l'embrió, al no aconseguir imitar les condicions maternals òptimes, per la qual cosa la seua aplicació implica conseqüències per al desenvolupament de l'organisme. L'objectiu general d'esta tesi va ser estudiar els efectes a llarg termini i transgeneracionals de l'estrés provocat durant un procediment de transferència d'embrions vitrificats, utilitzant el conill com a model animal. En el Capítol I, demostrem que la transferència de mórules primerenques o compactes resulta en taxes de supervivència al part > 70% en fresc i > 55% després de la vitrificació. La facilitat amb què es poden realitzar aquests procediments, l'elevat nombre de descendents que podem obtindre i el curt cicle de vida del conill, van fomentar i van facilitar els següents estudis. En el Capítol II, es van comparar les diferències en el desenvolupament a curt i llarg termini entre els animals nascuts d'embrions transferits en fresc (FT) o després de la seua vitrificació (VT), utilitzant una població concebuda de forma natural (NC) com a referència. Tant les taxes de supervivència prenatal, com el rendiment del creixement postnatal, es van reduir significativament a mesura que va augmentar la manipulació embrionària (NC<FT<VT). A més, es va comparar l'efecte de dos dispositius de vitrificació, observant que, encara que el cryotop va exercir un efecte positiu sobre la supervivència fetal, va implicar majors desviacions fenotípiques (rendiment de creixement i lactància) postnatalment que el dispositiu de la ministraw. No obstant això, totes les progènies van ser sanes i fèrtils. Per tant, estos resultats van demostrar la gran plasticitat de l'embrió de mamífer. L'objectiu del Capítol III va ser avaluar els efectes del procediment de transferència d'embrions vitrificats (VET) en el desenvolupament, comparant animals VT i NC. Així, vam detectar que els animals VT van presentar alteracions del pes al nàixer i del patró de creixement, veient-se els mascles més afectats que les femelles. En l'edat adulta, els mascles VT van presentar un menor pes corporal, del fetge i del cor. Un anàlisi proteòmic hepàtic va mostrar canvis en relació amb la fosforilació oxidativa i el metabolisme dels lípids i el zinc. Per mitjà d'un anàlisi de sang, es va comprovar que l'estat de salut entre els animals VT i NC era comparable. En el Capítol IV, es va constituir un model de tres generacions (F1, F2 i F3) per a avaluar els efectes transgeneracionals del VET. Els resultats van mostrar que els efectes directes (F1) del VET van ser intergeneracionals (F2) i transgeneracionals (F3), ja que les progènies VT van mostrar alteracions en el creixement, pes corporal adult i pes hepàtic. Un estudi molecular (transcriptòmic i metabolòmic) del teixit hepàtic va revelar alteracions en el metabolisme del zinc i els àcids grassos insaturats a través de les generacions, correlacionat amb el fenotip VT. No obstant això, la fertilitat va ser semblant entre els mascles VT i NC en cada generació, denotant un bon estat de salut. Finalment, en el Capítol V, per mitjà d'un enfocament comparatiu multi-òmic (metabolòmic, proteòmic i epigenòmic) del teixit hepàtic entre animals F3-VT i F3-NC, es va demostrar una alteració global de la fisiologia molecular en els animals VT, relacionada principalment amb el metabolisme dels lípids (àcids grassos poliinsaturats, esteroides, hormones esteroides...) . A més, es van detectar amplis canvis en l'epigenoma, demostrant l'herència transgeneracional dels canvis moleculars induïts pel VET en els embrions de la F1. L'estat de salut va ser semblant entre els animals VT i NC. Al llarg d'esta tesi s'ha demostrat, per primera vegada, que el VET indueix una reprogramació embrionària del desenvolupament que persisteix fins a l'edat adulta i en les generacions posteriors. [CA] Les tecnologies de reproducció assistida suposen un canvi dràstic en l'entorn natural de l'embrió, al no aconseguir imitar les condicions maternals òptimes, per la qual cosa la seua aplicació implica conseqüències per al desenvolupament de l'organisme. L'objectiu general d'esta tesi va ser estudiar els efectes a llarg termini i transgeneracionals de l'estrés provocat durant un procediment de transferència d'embrions vitrificats, utilitzant el conill com a model animal. En el Capítol I, demostrem que la transferència de mórules primerenques o compactes resulta en taxes de supervivència al part > 70% en fresc i > 55% després de la vitrificació. La facilitat amb què es poden realitzar aquests procediments, l'elevat nombre de descendents que podem obtindre i el curt cicle de vida del conill, van fomentar i van facilitar els següents estudis. En el Capítol II, es van comparar les diferències en el desenvolupament a curt i llarg termini entre els animals nascuts d'embrions transferits en fresc (FT) o després de la seua vitrificació (VT), utilitzant una població concebuda de forma natural (NC) com a referència. Tant les taxes de supervivència prenatal, com el rendiment del creixement postnatal, es van reduir significativament a mesura que va augmentar la manipulació embrionària (NC<FT<VT). A més, es va comparar l'efecte de dos dispositius de vitrificació, observant que, encara que el cryotop va exercir un efecte positiu sobre la supervivència fetal, va implicar majors desviacions fenotípiques (rendiment de creixement i lactància) postnatalment que el dispositiu de la ministraw. No obstant això, totes les progènies van ser sanes i fèrtils. Per tant, estos resultats van demostrar la gran plasticitat de l'embrió de mamífer. L'objectiu del Capítol III va ser avaluar els efectes del procediment de transferència d'embrions vitrificats (VET) en el desenvolupament, comparant animals VT i NC. Així, vam detectar que els animals VT van presentar alteracions del pes al nàixer i del patró de creixement, veient-se els mascles més afectats que les femelles. En l'edat adulta, els mascles VT van presentar un menor pes corporal, del fetge i del cor. Un anàlisi proteòmic hepàtic va mostrar canvis en relació amb la fosforilació oxidativa i el metabolisme dels lípids i el zinc. Per mitjà d'un anàlisi de sang, es va comprovar que l'estat de salut entre els animals VT i NC era comparable. En el Capítol IV, es va constituir un model de tres generacions (F1, F2 i F3) per a avaluar els efectes transgeneracionals del VET. Els resultats van mostrar que els efectes directes (F1) del VET van ser intergeneracionals (F2) i transgeneracionals (F3), ja que les progènies VT van mostrar alteracions en el creixement, pes corporal adult i pes hepàtic. Un estudi molecular (transcriptòmic i metabolòmic) del teixit hepàtic va revelar alteracions en el metabolisme del zinc i els àcids grassos insaturats a través de les generacions, correlacionat amb el fenotip VT. No obstant això, la fertilitat va ser semblant entre els mascles VT i NC en cada generació, denotant un bon estat de salut. Finalment, en el Capítol V, per mitjà d'un enfocament comparatiu multi-òmic (metabolòmic, proteòmic i epigenòmic) del teixit hepàtic entre animals F3-VT i F3-NC, es va demostrar una alteració global de la fisiologia molecular en els animals VT, relacionada principalment amb el metabolisme dels lípids (àcids grassos poliinsaturats, esteroides, hormones esteroides...) . A més, es van detectar amplis canvis en l'epigenoma, demostrant l'herència transgeneracional dels canvis moleculars induïts pel VET en els embrions de la F1. L'estat de salut va ser semblant entre els animals VT i NC. Al llarg d'esta tesi s'ha demostrat, per primera vegada, que el VET indueix una reprogramació embrionària del desenvolupament que persisteix fins a l'edat adulta i en les generacions posteriors. Es creu que els mecanismes epigenètics medien aquesta plasticitat del desenvolupament i la seua herència transgeneracional, un fet també avalat pels nostres resultats. Per tant, els diferents camps que actualment es nodreixen de la criopreservació i transferència d'embrions, com la medicina i la producció animal, haurien d'avaluar com aquests procediments poden afectar l'eficiència o la consecució dels seus objectius.